-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em> Drosophila</em> Tissues voor de analyse van genexpressie
Summary
Drosophila weefsels bevatten vaak een heterogeen mengsel van celtypen. Om genexpressie in bepaalde celtypes van een bepaald weefsel te onderzoeken, kan kernen genetisch gemerkt en vervolgens geïsoleerd met behulp van een op affiniteit gebaseerde benadering. Geïsoleerde kernen kan worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals genexpressie analyse en chromatine immunoprecipitatie.
Abstract
Drosophila melanogaster embryonale en larvale weefsels bevatten vaak een zeer heterogeen mengsel van celtypen, welke de analyse van genexpressie kan bemoeilijken in deze weefsels. Dus, om cel-specifieke genexpressie van Drosophila weefsels te analyseren, kan het nodig zijn om specifieke celtypen met hoge zuiverheid en in voldoende hoge opbrengsten van verdere toepassingen zoals transcriptionele profilering en chromatine immunoprecipitatie isoleren. Echter, de onregelmatige cellulaire morfologie in weefsels zoals het centrale zenuwstelsel, in combinatie met de zeldzame populatie van specifieke celtypen in deze weefsels, uitdaging vormen voor traditionele methoden celisolatie zoals laser-microdissectie en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) . Hier, een alternatieve benadering karakteriseren cel-specifieke genexpressie middels affiniteit isoleert gelabeld kernen, in plaats van hele cellen, wordt beschreven. Kernen in de specifieke cell type belang zijn genetisch gelabeld met een nucleair-envelop gelokaliseerde EGFP tag met behulp van de Gal4/UAS binaire expressie systeem. Deze-EGFP gelabeld kernen kunnen worden geïsoleerd met antilichamen tegen GFP die zijn gekoppeld aan magnetische korrels. De in dit protocol beschreven benadering maakt consistente isolatie van kernen van bepaalde celtypes in het Drosophila larven centrale zenuwstelsel bij hoge zuiverheid en op voldoende niveau voor expressie analyse, zelfs wanneer deze celtypen omvatten minder dan 2% van de totale celpopulatie in de weefsel. Deze benadering kan gebruikt worden om kernen te isoleren uit een grote verscheidenheid van Drosophila embryo's en larven celtypes in specifieke Gal4 drivers, en kunnen bruikbaar zijn voor het isoleren kernen van celtypen die niet geschikt is voor FACS of laser microdissectie bent.
Introduction
Drosophila weefsels zoals het centrale zenuwstelsel bevatten een complex mengsel van celtypen. Dus, om cel-specifieke genexpressie profielen van Drosophila weefsels te analyseren, is het eerst nodig om een homogene populatie van specifieke cellen isoleren in voldoende hoeveelheden aan downstream-toepassingen mogelijk te maken. Werkwijzen om cellen te isoleren uit intacte weefsels omvatten laser-microdissectie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van gehele cellen. Hoewel FACS werd gebruikt om cellen en kernen isoleren van Drosophila embryo's en van Caenorhabditis elegans voor genexpressie en chromatine profilering 1-3, kan FACS en laser microdissectie moeilijk succesvol presteren in weefsels die sterk vermengd celtypes bevatten of die cellen bevatten met onregelmatige morfologie, zoals neuronen. Om deze moeilijkheid te overwinnen, kan kernen plaats cellen geïsoleerd uit specifieke celtypen en gebruikt voor daaropvolgende gene expressie profilering. Belangrijk microarray gebaseerde mRNA analyse met behulp van RNA monsters nucleaire toont algemeen vergelijkbare resultaten met die uitgevoerd met totaal RNA 4, 5. Bovendien genexpressie analyse met behulp van nucleaire RNA is met succes gebruikt om genexpressie in diverse organismen, waaronder C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila en mensen 4, 5 2, 3.
Verschillende benaderingen zijn onlangs beschreven voor het isoleren van specifieke populaties van gemerkte kernen van Drosophila weefsels die geschikt zijn voor genexpressie-analyse en / of chromatine immunoprecipitatie zijn. De partij isolatie van weefsel-specifieke chromatine voor methode immunoprecipitation (bits-chip) maakt gebruik van FACS om vaste kernen isoleren op basis van celtype specifieke expressie van de nucleaire-gelokaliseerde GFP 2. Deze aanpak is successfully gebruikt om de verdeling van histon modificaties en transcriptiefactoren met chromatine immunoprecipitatie van geïsoleerde kernen uit het mesoderm van Drosophila embryo 2 analyseren. Kunnen echter FACS-gebaseerde benaderingen minder geschikt voor het isoleren gemerkte kernen die slechts een klein deel van een gemengde populatie vanwege de toegenomen sorteren tijd nodig om geschikte nummers voor verdere toepassingen vinden vormen. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben verschillende groepen affiniteit gebaseerde isolatietechnieken gebruikt voor kernen die gelabeld zijn met een specifiek epitoop in een bepaald celtype zuiveren. De isolatie van kernen gelabeld in specifieke celtypen (ONBESCHADIGDE) methode ontwikkeld voor Arabidopsis thaliana 6, 7 is onlangs aangepast voor gebruik in Drosophila 8. In deze methode wordt een envelop fusie-nucleair eiwit dat een substraat voor in vivo biotinylering is coexpressed de Escherichia coli biotine ligase BirA in bepaalde celtypes. Biotine gelabelde kernen kan vervolgens worden gezuiverd uit gemengde populaties met streptavidine gebaseerde affiniteit isolatie. Met deze benadering werden kernen succes gelabeld en geïsoleerd van het mesoderm van Drosophila embryo, waarin een envelop fusie-nucleaire eiwit werd tot expressie gebracht onder controle van een mesoderm-specifieke enhancer 8. De auteurs ook gegenereerd nucleaire envelop fusie-eiwitten die kunnen worden uitgedrukt in elk celtype onder controle van de regulerende sequentie Gal4, UAS 9. Deze benadering kan snel isoleren van deelverzamelingen van gemerkte kernen van gemengde populaties, maar vereist drie afzonderlijke transgene constructen en derhalve ongeschikt voor bepaalde genetische toepassingen. Onlangs is een aanpak beschreven waarbij SUN (S AD1 en UN C-84)-domein bevattende eiwitten die lokaliseren naar de binnenmembraan van de nucleaire envelop werden gelabeld metfluorescente eiwitten en expressie onder controle van de Gal4/UAS systeem 10. Kernen werden geïsoleerd in aanwezigheid van ionische detergens aan de buitenste membraan van de kern envelop te verwijderen en affiniteit-gezuiverd via magnetische partikels gekoppeld met anti-GFP antilichamen. Deze aanpak is succesvol gebruikt om kleine populaties van gemerkte kernen van specifieke neuronale subtypes in volwassen hersenen van Drosophila 10 isoleren.
Hier is een protocol voor isolatie van gemerkte kernen uit een gemengde populatie van cellen van Drosophila larven weefsel beschreven. Deze methode is onafhankelijk ontwikkeld, maar vergelijkbaar met de werkwijze beschreven door Henry et al.. 10 eerste benadering werden kernen gelabeld met een fluorescerend label dat tot expressie alleen in specifieke celtypen in Drosophila melanogaster de daaropvolgende isolatie van gemerkte kernen van gemengde populaties vergemakkelijken met een affiniteit gebaseerde benadering. Om kernen te etiketteren,de KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology) domein werd gebruikt. De KASH domein is een transmembraan domein dat lokaliseert naar de buitenste membraan van de nucleaire envelop, mede door interacties met SUN-domein-bevattende eiwitten in de perinucleaire ruimte 11. De C-terminale domein van KASH eiwitten zoals Drosophila Msp-300 en Klarsicht verankert deze eiwitten aan de buitenste kernmembraan, terwijl hun N-terminale domeinen wisselwerking met cytoskelet eiwitten zoals actine en microtubuli in het cytoplasma 12-14. Constructen werden gegenereerd waarin de KASH domein van Drosophila Msp-300 werd gefuseerd met het C-uiteinde van EGFP, onder controle van de regulerende sequentie Gal4, UAS in de pUAST-attB vector 15, 16. Met phiC31 plaatsspecifieke integratie, werden transgene vliegen gegenereerd waarin de UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgen is in het attP2 loci op chromosoom ingevoegd3L 17. De UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vliegt kan worden gekruist met vliegen die de Gal4 driver drukken in een bepaald celtype, waardoor de gerichte expressie van EGFP op de buitenste kernmembraan in het celtype van interesse. Gemerkte kernen kan vervolgens worden gezuiverd uit gemengde celpopulaties met antilichamen tegen GFP gekoppeld aan magnetische korrels. In deze benadering is het gebruik van ionische detergens niet vereist omdat de EGFP tag gelokaliseerd aan de cytoplasmatische zijde van het buitenste kernmembraan en derhalve toegankelijk voor antilichamen.
Het hieronder beschreven protocol kan worden gebruikt voor het isoleren / verrijken-EGFP gemerkte kernen van specifieke celtypen in Drosophila larvale weefsels, de zuiverheid en opbrengst van geïsoleerde kernen kwantificeren, en nucleaire RNA extract voor kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT -PCR) analyse van genexpressie. De isolatie en zuivering van affiniteit-kernen (exclusief tissue dissectie) kan worden uitgevoerd in minder dan een uur. De resultaten worden weergegeven die gliale kernen succes kan worden geïsoleerd uit het larvale optische kwab en oog verbeelding schijf, en gebruikt voor daaropvolgende analyse van genexpressie. Verwacht wordt dat deze benadering bruikbaar voor de isolatie / verrijking van gemerkte kernen van embryonale en larvale weefsels waarin de doelcellen deze minder dan 5% van de totale bevolking is. Alle Drosophila voorraden en plasmiden die uit dit onderzoek zijn verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol kan worden gebruikt voor het isoleren of verrijken zeer specifiek gelabeld kernen van gemengde celpopulaties in Drosophila embryonale en larvale weefsels. Met dit protocol kunnen worden geïsoleerd uit kernen ontleed weefsel in ongeveer 1 uur. De zuiverheid en de opbrengst van de geïsoleerde kernen moet proefondervindelijk worden bepaald voor elk type cel. Het kan moeilijk zijn om de kraal gebonden kernen kwantificeren bij de post-isolatie fase van het protocol met behulp van een hemocytometer van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Janice Fischer voor het verstrekken van de UAS-EGFP :: Msp-300 KASH plasmide. De mAB24B10 antilichaam werd verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Departement Biologie. De repo-GAL4 voorraad (BL7415) werd verkregen uit de Bloomington Stock Center aan de Universiteit van Indiana. Steun van de American Cancer Society Institutioneel Onderzoek Subsidie (IRG # 58-006-53) aan de Purdue University Center for Cancer Research is dankbaar erkend. Jingqun Ma wordt ondersteund door een landbouwkundig onderzoek aan de Purdue-assistentschap in Voedsel-en Landbouworganisatie van de Purdue University.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
- Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
- Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
- Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. 유전학. 168, 1385-1393 (2004).
- Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
- Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
- Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).
