Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em> Drosophila</em> Tücher für Genexpressionsanalyse
Summary
Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden.
Abstract
Drosophila melanogaster und embryonalen Geweben der Larven enthalten oft ein sehr heterogenes Gemisch von Zelltypen, die die Analyse der Genexpression in diesen Geweben erschweren kann. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, kann es notwendig sein, bestimmte Zelltypen mit hoher Reinheit und in Ausbeuten ausreichend für nachfolgende Anwendungen wie Transkriptionsprofiling und Chromatin-Immunopräzipitation isoliert. Jedoch kann die unregelmäßige Zellmorphologie in Geweben wie dem zentralen Nervensystem, verbunden mit der seltenen Population von spezifischen Zelltypen in diesen Geweben, Herausforderungen für herkömmliche Methoden der Zellisolierung wie Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung darstellen (FACS) . Hier wird ein alternativer Ansatz zur Charakterisierung zellspezifische Genexpressionsprofilen unter Verwendung von Affinitäts-basierte Isolierung von markierten Kerne, anstatt ganzer Zellen, beschrieben. Kerne in der spezifischen cell Art von Interesse sind genetisch mit einer Kernhülle lokalisierte EGFP-Tag mit der GAL4/UAS binären Expressionssystem gekennzeichnet. Diese EGFP-markierte Kerne können mit Antikörpern gegen GFP, die an magnetische Kügelchen gekoppelt sind, isoliert werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Ansatz ermöglicht eine konstante Trennung der Kerne von spezifischen Zelltypen in Drosophila Larven des zentralen Nervensystems bei hoher Reinheit und in ausreichenden Mengen für die Expressionsanalyse, auch wenn diese Zelltypen enthalten weniger als 2% der Gesamtzellpopulation in der Gewebe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Kerne aus einer Vielzahl von embryonalen und larvalen Drosophila Zelltypen mit spezifischen Gal4 Treiber zu isolieren, und kann zur Isolierung von Kernen von Zelltypen, die nicht geeignet für die FACS oder Laser Mikrodissektion werden können.
Introduction
Drosophila-Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem enthalten ein komplexes Gemisch von Zelltypen. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, ist es zunächst notwendig, eine homogene Population von spezifischen Zellen in ausreichenden Mengen zu isolieren, um Downstream-Anwendungen zu ermöglichen. Verfahren, um Zellen von intakten Geweben zu isolieren, umfassen Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von ganzen Zellen. Während FACS wurde verwendet, um Zellen und Zellkerne von Drosophila-Embryonen und aus Caenorhabditis elegans zur Genexpression und Chromatin Profilierung 1-3 isolieren kann FACS und Laser Mikrodissektion schwierig sein, in Geweben, die stark vermischten Zelltypen oder enthalten, dass die Zellen mit enthalten, erfolgreich durchführen unregelmäßige Morphologie, wie Neuronen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, können Kerne anstatt Zellen aus spezifischen Zelltypen isoliert und für die nachfolgende Generation verwendet werden,e Expression Profiling. Wichtig ist, Microarray-basierte mRNA-Expressionsanalyse, die Kern RNA-Proben zeigt allgemein vergleichbare Ergebnisse bei der Verwendung von Gesamt-RNA, 4, 5 durchgeführt. Darüber hinaus hat die Genexpressionsanalyse mit Kern-RNA wurde erfolgreich eingesetzt, um die Genexpression in mehreren Organismen einschließlich C. studieren elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila und Menschen 4, 5 2, 3.
Mehrere Ansätze wurden kürzlich für die Isolierung von spezifischen Populationen von markierten Kerne aus Drosophila Gewebe, geeignet für Genexpressionsanalyse und / oder Chromatinimmunpräzipitation sind beschrieben worden. Die Batch-Isolierung von Gewebe-spezifische Chromatin für die Immunpräzipitation (BiTS-Chip-) Verfahren nutzt FACS festen Kerne auf der Basis von Zelltyp-spezifische Expression von Kern lokalisierte GFP 2 isolieren. Dieser Ansatz war successfully verwendet, um die Verteilung von Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation von isolierten Kernen aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen 2 analysieren. Jedoch kann FACS-basierte Ansätze zur Isolierung markierten Kerne, die nur einen geringen Anteil an einer gemischten Population aufgrund der erhöhten Zeitaufwand für die Art geeignet Nummern für Downstream-Anwendungen zu erhalten, machen weniger geeignet sein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere Gruppen Affinitäts-Isolationstechniken genutzt werden, um Kerne, die mit einem bestimmten Epitop in einem bestimmten Zelltyp gekennzeichnet sind, zu reinigen. Die Isolierung von Zellkernen in spezifischen Zelltypen (intakt) Verfahren zur Verwendung in Arabidopsis thaliana 6, 7 entwickelt markiert wurde kürzlich für die Verwendung in Drosophila 8 angepasst. Bei diesem Verfahren ist eine Kernhülle Fusionsprotein, das ein Substrat für die in vivo-Biotinylierung coexpressed mit dem Escherichia coli Biotinligase BirA in bestimmten Zelltypen. Biotin-markierte Kerne kann anschließend von Mischpopulationen unter Verwendung von Streptavidin-basierte Affinitätsisolierung gereinigt werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden Kerne erfolgreich markiert und aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen, in dem eine Kernhülle-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Mesoderm-spezifischen Enhancer exprimiert 8 isoliert. Die Autoren erzeugten Kernhüllenfusionsproteine, die in jedem Zelltyp unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS 9 ausgedrückt werden kann. Dieser Ansatz ist in der Lage, schnell zu isolieren Teilmengen von markierten Kerne von Mischpopulationen, erfordert aber drei separate transgene Konstrukte und kann daher für bestimmte genetische Anwendungen ungeeignet sein. Vor kurzem wurde ein Ansatz beschrieben, bei dem so (S ad1 und UN-C-84)-Domäne enthalten Proteine, die an der inneren Membran der Kernhülle zu lokalisieren, wurden mit dem Stichwortfluoreszierende Proteine und unter der Steuerung des Systems 10 GAL4/UAS ausgedrückt. Kerne wurden in Gegenwart von nichtionischen Detergens isoliert, um die äußere Membran von der Kernhülle zu entfernen, und affinitätsgereinigt unter Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Anti-GFP-Antikörper gekoppelt. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um kleine Populationen von markierten Kerne von spezifischen neuronalen Subtypen im erwachsenen Gehirn von Drosophila 10 zu isolieren.
Hier wird ein Protokoll für die Isolierung der markierten Kerne aus einer gemischten Population von Zellen von Drosophila-Larven Gewebe beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, unabhängig, aber ist ähnlich dem von Henry et al. 10 zuerst beschriebenen Ansatz wurden Kerne mit einer fluoreszierenden Markierung, die nur in bestimmten Zelltypen in Drosophila exprimiert wird, um die anschließende Trennung von markierten Kerne aus gemischten Populationen erleichtern markierten mit einer Affinität-basierten Ansatz. Um Keime zu kennzeichnen,die KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology)-Domäne wurde eingesetzt. Die KASH Domäne eine Transmembrandomäne, die an die äußere Membran der Kernhülle, teilweise durch Wechselwirkung mit SUN-Domäne enthaltenden Proteinen innerhalb der perinukleären Raum 11 lokalisiert. Die C-terminale Domäne von KASH Proteine wie Drosophila Msp-300 und Klarsicht verankert diese Proteine an der äußeren Kernmembran, während die N-terminalen Domänen interagieren mit Cytoskelett-Proteine wie Aktin oder Mikrotubuli im Zytoplasma 12-14. Konstrukte wurden erzeugt, in dem die KASH Domäne von Drosophila Msp-300 wurde unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS in der pUAST attB-Vektor 15, 16 an den C-Terminus von EGFP fusioniert. Mit phiC31 ortsspezifische Integration wurden transgene Fliegen erzeugt, in dem die UAS-EGFP :: Msp-300-KASH Transgen wurde in der attP2 Loci auf Chromosom eingefügt3L 17. Die FH-EGFP :: Msp-300-KASH fliegt mit Fliegen, die das Gal4-Treiber zum Ausdruck in einem bestimmten Zelltyp, was die gezielte Expression von EGFP auf der äußeren Kernmembran in den Zelltyp von Interesse überquert werden. Markierte Kerne können dann aus gemischten Zellpopulationen mit Antikörpern gegen GFP an magnetische Kügelchen gekoppelt gereinigt werden. In diesem Ansatz wird die Verwendung von nichtionischen Detergens nicht erforderlich, da das EGFP-Tag an der zytoplasmatischen Seite der äußeren Kernmembran lokalisiert, und ist daher für Antikörper zugänglich.
Die unten beschriebene Protokoll kann zur Isolierung / bereichern EGFP-markierten Kerne von bestimmten Zelltypen in Drosophila Larvengewebe, um die Reinheit und Ausbeute der isolierten Zellkernen zu quantifizieren und Kern-RNA zu extrahieren geeignet für quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT werden -PCR) Genexpressionsanalyse. Die Isolierung und Reinigung von Affinität-Kerne (ohne tissuPräparation E) kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Ergebnisse dargestellt, die die Gliazellen Kerne erfolgreich vom Larvenoptischen Keule und Augen Imaginalscheibe isoliert werden und für nachfolgende Genexpressionsanalyse verwendet. Es ist zu erwarten, dass dieser Ansatz nützlich für die Isolierung / Anreicherung der markierten Kerne aus embryonalen und larvalen Geweben, in denen die Zielzellen weniger als 5% der Gesamtpopulation darstellen können. Alle Drosophila Aktien und Plasmide in dieser klinischen Studie sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol can be used to isolate or highly enrich specifically tagged nuclei from mixed cell populations in Drosophila embryonic or larval tissues. Using this protocol, nuclei can be isolated from dissected tissues in approximately 1 hr. The purity and yield of the isolated nuclei must be experimentally determined for each cell type. It can be difficult to quantify the bead-bound nuclei at the post-isolation stage of the protocol using a hemocytometer because of the beads present in the sample. Thus, if exac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Janice Fischer for providing the UAS-EGFP::Msp-300KASH plasmid. The mAB24B10 antibody was obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and maintained by the University of Iowa, Department of Biology. The repo-GAL4 stock (BL7415) was obtained from the Bloomington Stock Center at Indiana University. Support from the American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG #58-006-53) to the Purdue University Center for Cancer Research is gratefully acknowledged. Jingqun Ma is supported by an Agricultural Research at Purdue Assistantship in Food and Agriculture from Purdue University.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
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