से टैग्ड नाभिक की आत्मीयता के आधार पर अलगाव<em> ड्रोसोफिला</emजीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए> टिश्यूज
Summary
ड्रोसोफिला ऊतकों अक्सर सेल प्रकार की एक विषम मिश्रण होते हैं. एक विशेष ऊतकों से विशेष प्रकार की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, नाभिक आनुवंशिक रूप में चिह्नित है और बाद में एक समानता आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. पृथक नाभिक ऐसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और chromatin immunoprecipitation रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर भ्रूण और लार्वा ऊतकों अक्सर इन ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण जटिल हो सकता है, जो सेल प्रकार की एक अत्यधिक विषम मिश्रण होते हैं. इस प्रकार, ड्रोसोफिला ऊतकों से सेल विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए, यह उच्च शुद्धता के साथ और ऐसे transcriptional रूपरेखा और chromatin immunoprecipitation रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त पैदावार पर विशेष प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. हालांकि, इन ऊतकों में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के दुर्लभ आबादी के साथ मिलकर इस तरह के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में ऊतकों में अनियमित सेलुलर आकारिकी,, छँटाई ऐसी लेजर microdissection और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल के रूप में सेल अलगाव के पारंपरिक तरीकों के लिए (FACS) चुनौतियां खड़ी कर सकते हैं . इधर, में चिह्नित नाभिक की समानता के आधार पर अलगाव, बजाय पूरे कोशिकाओं का उपयोग सेल विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निस्र्पक के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण वर्णित है. विशिष्ट सी में नाभिकब्याज के पक्ष प्रकार आनुवंशिक रूप Gal4/UAS द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर एक परमाणु लिफाफा स्थानीय EGFP टैग के साथ चिह्नित कर रहे हैं. ये EGFP टैग नाभिक चुंबकीय मोतियों के लिए मिलकर कर रहे हैं कि GFP के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण इन प्रकार की कोशिकाओं में कुल सेल की आबादी का कम से कम 2% शामिल है, जब भी उच्च शुद्धता पर ड्रोसोफिला लार्वा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में और अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए पर्याप्त स्तर पर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं से नाभिक की लगातार अलगाव में सक्षम बनाता है ऊतक. यह दृष्टिकोण ड्रोसोफिला भ्रूण और विशिष्ट Gal4 ड्राइवरों का उपयोग लार्वा सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता से नाभिक को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और FACS या लेजर microdissection के लिए उपयुक्त नहीं हैं कि सेल प्रकार से नाभिक अलग करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
Introduction
इस तरह के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में ड्रोसोफिला ऊतकों प्रकार की कोशिकाओं का एक जटिल मिश्रण होते हैं. इस प्रकार, ड्रोसोफिला ऊतकों से सेल विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए, यह बहाव के अनुप्रयोगों को सक्षम करने के लिए पर्याप्त मात्रा में विशिष्ट कोशिकाओं का एक समरूप जनसंख्या को अलग करने के लिए पहली आवश्यक है. बरकरार ऊतकों से कोशिकाओं को अलग तरीके लेजर microdissection, और पूरे कोशिकाओं की छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल शामिल हैं. FACS 1-3 रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति और chromatin के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण से और Caenorhabditis एलिगेंस से कोशिकाओं और नाभिक अलग करने के लिए प्रयोग किया गया है, FACS और लेजर microdissection अत्यधिक intermixed प्रकार की कोशिकाओं या कि होते कोशिकाओं के साथ होते हैं कि ऊतकों में सफलतापूर्वक प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है ऐसे न्यूरॉन्स के रूप में अनियमित आकृति विज्ञान,. इस कठिनाई को दूर करने के लिए, बल्कि कोशिकाओं की तुलना में नाभिक विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं से अलग किया और बाद में जनरल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैई अभिव्यक्ति की रूपरेखा. महत्वपूर्ण बात है, परमाणु शाही सेना के नमूने का उपयोग माइक्रोएरे आधारित mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण कि कुल शाही सेना 4, 5 का उपयोग कर प्रदर्शन के साथ आमतौर पर तुलनीय परिणाम से पता चलता है. इसके अलावा, परमाणु शाही सेना का उपयोग जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सफलतापूर्वक सी. सहित कई जीवों में जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है एलिगेंस, Arabidopsis thaliana, ड्रोसोफिला, और मनुष्यों 4, 5, 2, 3.
कई तरीकों हाल ही में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और / या chromatin immunoprecipitation के लिए उपयुक्त हैं कि ड्रोसोफिला ऊतकों से लेबल नाभिक के विशिष्ट आबादी के अलगाव के लिए वर्णित किया गया है. immunoprecipitation (बिट्स चिप) विधि के लिए ऊतक विशेष chromatin के बैच अलगाव परमाणु स्थानीयकृत GFP 2 के सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के आधार पर तय नाभिक अलग करने के लिए FACS का इस्तेमाल करता. यह दृष्टिकोण सु किया गया हैccessfully ड्रोसोफिला भ्रूण 2 की mesoderm से अलग नाभिक की chromatin immunoprecipitation का उपयोग histone संशोधनों और प्रतिलेखन कारक के वितरण का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, FACS आधारित दृष्टिकोण के कारण बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक वृद्धि की तरह समय के लिए एक मिश्रित आबादी के केवल एक छोटे से अनुपात है कि गठन लेबल नाभिक अलग करने के लिए कम उपयुक्त हो सकता है. इन सीमाओं को पार करने के लिए, कई समूहों को एक विशेष सेल प्रकार में एक विशिष्ट मिलान के साथ चिह्नित कर रहे हैं कि नाभिक को शुद्ध करने के लिए समानता के आधार पर अलगाव की तकनीक का उपयोग किया है. Arabidopsis thaliana 6, 7 में इस्तेमाल के लिए विकसित विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं (अक्षुण्ण) विधि में टैग नाभिक का अलगाव हाल ही में ड्रोसोफिला 8 में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया है. इस विधि में, vivo biotinylation के लिए एक सब्सट्रेट है कि एक परमाणु लिफाफा संलयन प्रोटीन coexpres हैविशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में ई. कोलाई बायोटिन ligase बीरा के साथ SED. बायोटिन लेबल नाभिक बाद में streptavidin आधारित आत्मीयता अलगाव का उपयोग मिश्रित आबादी से शुद्ध किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, नाभिक सफलतापूर्वक एक परमाणु लिफाफा संलयन प्रोटीन एक mesoderm विशेष बढ़ाने 8 के नियंत्रण में व्यक्त की गई थी जिसमें ड्रोसोफिला भ्रूण की mesoderm से लेबल और अलग थे. लेखकों को भी Gal4 विनियामक अनुक्रम, यूएएस 9 के नियंत्रण में किसी भी कोशिका प्रकार में व्यक्त किया जा सकता है कि परमाणु लिफाफा संलयन प्रोटीन उत्पन्न. यह दृष्टिकोण तेजी से मिश्रित आबादी से लेबल नाभिक के सबसेट अलग करने में सक्षम है, लेकिन तीन अलग ट्रांसजेनिक निर्माणों की आवश्यकता है और इसलिए विशेष रूप से आनुवंशिक अनुप्रयोगों के लिए अनुपयुक्त हो सकती है. हाल ही में, एक दृष्टिकोण रवि (एस AD1 और संयुक्त राष्ट्र के सी -84) परमाणु लिफाफा के भीतर की झिल्ली को कि स्थानीय डोमेन युक्त प्रोटीन के साथ टैग कर रहे थे, जिसमें वर्णित किया गया हैफ्लोरोसेंट प्रोटीन और Gal4/UAS प्रणाली 10 के नियंत्रण में व्यक्त किया. नाभिक परमाणु लिफाफा की बाहरी झिल्ली को दूर करने के nonionic डिटर्जेंट की मौजूदगी में अलग, और विरोधी GFP एंटीबॉडी के लिए युग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग आत्मीयता शुद्ध गया. यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला 10 के वयस्क मस्तिष्क के भीतर विशिष्ट neuronal उपप्रकार से लेबल नाभिक की छोटी आबादी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
इधर, ड्रोसोफिला लार्वा ऊतकों से कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी से लेबल नाभिक के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि स्वतंत्र रूप से विकसित, लेकिन हेनरी एट अल. 10 पहले से वर्णित दृष्टिकोण के समान हो गया है, नाभिक मिश्रित आबादी से टैग किया नाभिक के बाद अलगाव की सुविधा के लिए ही ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त किया है कि एक फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल रहे थे एक आकर्षण आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर. नाभिक लेबल करने के लिए,कश्मीरियों (कश्मीर larsicht / A नेकां -1 / एस yne घंटे omology) डोमेन का उपयोग किया गया था. कश्मीरियों डोमेन perinuclear अंतरिक्ष 11 भीतर धूप डोमेन युक्त प्रोटीन के साथ बातचीत के माध्यम से हिस्से में परमाणु लिफाफा की बाहरी झिल्ली, localizes कि एक transmembrane डोमेन है. उनके एन टर्मिनल डोमेन ऐसी कोशिका द्रव्य 12-14 में actin या सूक्ष्मनलिकाएं रूप cytoskeleton प्रोटीन के साथ बातचीत करते हुए इस तरह के ड्रोसोफिला एमएसपी 300 और Klarsicht के रूप में प्रोटीन की सी टर्मिनल कश्मीरियों डोमेन, बाहरी परमाणु झिल्ली को इन प्रोटीनों एंकर. निर्माणों जिसमें ड्रोसोफिला एमएसपी 300 के कश्मीरियों डोमेन pUAST-attB वेक्टर 15, 16 में Gal4 विनियामक अनुक्रम, यूएएस के नियंत्रण के तहत, EGFP के सी टर्मिनस से इनकार किया गया था उत्पन्न किया गया. PhiC31 साइट विशेष एकीकरण का उपयोग करना, ट्रांसजेनिक मक्खियों उत्पन्न थे यूएएस EGFP :: एमएसपी 300 कश्मीरियों transgene गुणसूत्र पर attP2 loci में डाला गया था जो में3L 17. यूएएस EGFP :: एमएसपी 300 कश्मीरियों मक्खियों ब्याज की कोशिका प्रकार में बाहरी परमाणु झिल्ली पर EGFP के लक्षित अभिव्यक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप एक विशेष सेल प्रकार में Gal4 ड्राइवर व्यक्त कि मक्खियों के साथ पार किया जा सकता है. लेबल वाले नाभिक तो चुंबकीय मोतियों के लिए युग्मित GFP के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग मिश्रित सेल आबादी से शुद्ध किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण में, nonionic डिटर्जेंट के उपयोग EGFP टैग बाहरी परमाणु झिल्ली की cytoplasmic ओर करने के लिए स्थानीय है क्योंकि आवश्यक है, और इसलिए एंटीबॉडी के लिए सुलभ नहीं है.
नीचे वर्णित प्रोटोकॉल पवित्रता और अलग नाभिक की उपज यों, ड्रोसोफिला लार्वा ऊतकों में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं से EGFP लेबल नाभिक को समृद्ध / अलग करने के लिए, और (मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के लिए उपयुक्त परमाणु शाही सेना को निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता qRT पीसीआर) जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण. नाभिक का अलगाव और आत्मीयता शुद्धि (Tissu छोड़करई विच्छेदन) कम से कम एक घंटे में किया जा सकता है. परिणाम glial नाभिक सफलतापूर्वक लार्वा ऑप्टिक पालि और आंख imaginal डिस्क से अलग, और बाद में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखा रहा है कि प्रस्तुत कर रहे हैं. यह इस दृष्टिकोण लक्ष्य कोशिकाओं कुल आबादी का कम से कम 5% का गठन, जिसमें भ्रूण और लार्वा ऊतकों से लेबल नाभिक का अलगाव / संवर्धन के लिए उपयोगी हो जाएगा अनुमान है कि. इस अध्ययन में उत्पन्न सभी ड्रोसोफिला स्टॉक और plasmids अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला भ्रूण या लार्वा ऊतकों में मिश्रित सेल आबादी से विशेष रूप में चिह्नित नाभिक अलग या अत्यधिक समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, नाभिक लगभग 1 घं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम यूएएस EGFP :: एमएसपी 300 कश्मीरियों प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए जेनिस फिशर धन्यवाद. mAB24B10 एंटीबॉडी NICHD के तत्वावधान में विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त की और आयोवा विश्वविद्यालय, जीवविज्ञान विभाग द्वारा बनाए रखा गया था. रेपो-GAL4 शेयर (BL7415) इंडियाना विश्वविद्यालय में ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र से प्राप्त हुई थी. कैंसर अनुसंधान के लिए पर्ड्यू विश्वविद्यालय केंद्र के लिए अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान (IRG # 58-006-53) से समर्थन कृतज्ञता से स्वीकार किया है. Jingqun मा पर्ड्यू विश्वविद्यालय से खाद्य और कृषि में पर्ड्यू Assistantship में एक कृषि अनुसंधान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
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