초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
초파리의 melanogaster 배아와 유충 조직은 종종 이들 조직에서의 유전자 발현 분석을 복잡하게 세포 유형의 고도로 이종 혼합물을 함유한다. 따라서, 초파리 조직으로부터 세포 특정 유전자 발현 프로파일을 분석하는, 높은 순도와 같은 전사 프로파일 링 및 염색질 면역 하류 어플리케이션에 충분한 수율에서 특정 세포 유형을 분리 할 필요가있다. 그러나 이러한 조직의 특정 세포 유형의 희귀 인구와 결합 등의 중추 신경계와 같은 조직의 불규칙한 세포의 형태는, 정렬, 레이저 미세 절제와 형광 활성화 된 세포로 세포 분리의 전통적인 방법에 대해 (FACS)에 도전을 제기 할 수 있습니다 . 여기서, 태그 핵의 궁합 기반 격리보다는 전체 세포를 사용하여 셀 고유의 유전자 발현 프로파일을 특징 화하는 대안 적 접근법이 설명된다. 특정 C의 핵관심 엘 유형은 유전 Gal4/UAS 진 발현 시스템을 이용하여 핵 봉투 지역화 EGFP 태그로 표시되어 있습니다. 이 EGFP-태그 된 핵은 자성 비드에 결합된다 GFP에 대한 항체를 사용하여 단리 할 수있다. 이 프로토콜에서 설명하는 방법은 이러한 세포 유형에서 전체 세포 집단의 2 % 미만을 포함하는 경우에도, 고순도 초파리 유충의 중추 신경계와 발현 분석을위한 충분한 수준에서 특정 세포 유형의 핵의 일관된 분리를 가능하게 조직. 이 접근법은 초파리 배아 특정 인 Gal4 드라이버를 사용 유생 세포 유형의 다양한 핵을 분리하기 위해 사용될 수 있으며, FACS 또는 레이저 미세 절제를 위해 적당하지 않은 종류의 세포에서 핵을 분리하는 데 유용 할 수있다.
서론
이러한 중추 신경계로서 초파리 조직 세포 유형의 복합 혼합물을 포함한다. 따라서, 초파리 조직으로부터 세포 특정 유전자 발현 프로파일을 분석하는데, 이는 다운 스트림 애플리케이션을 활성화하기에 충분한 양으로 특정한 세포 균질 집단을 분리하는 제 필요하다. 손상 조직에서 세포를 분리하는 방법은 레이저 미세 절제하고, 전체 세포 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀 (가) 있습니다. FACS는 1-3 프로파일 유전자 발현과 크로 마틴에 초파리의 배아에서와 예쁜 꼬마 선충의 세포와 핵을 분리하는 데 사용되었지만, FACS 및 레이저 미세 절제는 매우 혼합 세포 유형 또는 해당 포함 세포를 포함하는 조직에서 성공적으로 수행하기가 어려울 수 있습니다 뉴런과 같은 불규칙한 형태. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 오히려 세포보다 핵은 특정 세포 유형에서 분리 및 후속 세대를 위해 사용될 수있다전자 발현 프로파일 링. 중요한 것은, 핵 RNA 샘플을 사용하여 마이크로 어레이 기반의 mRNA 발현 분석은 그 전체 RNA 4, 5를 이용하여 수행 일반적으로 대등 한 결과를 나타낸다. 더욱이, 핵 RNA를 이용한 유전자 발현 분석은 성공적 C. 등 여러 유기체에서 유전자 발현을 연구하기 위....
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프로토콜
1. EGFP의 생성 및 특성 :: KASH 초파리
- 크로스 인 Gal4 드라이버는 MSP-300 KASH 날아 UAS-EGFP :: 운항하는 항공사. 대안 적으로, 인 Gal4 드라이버와 UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 형질 전환 유전자를 모두 전송할 재조합 파리 표준 유전 기술을 이용하여 생성 될 수있다. 자손의 큰 숫자가 필요한 경우이 두 번째 방법은 유리하다.
- 표준 현미경 기술을 사용하여 EGFP :: KASH 마커의 발현을 특징. 참고 : EGFP 발현 또는 전체 유충, 해부 고정 초파리 조직에서 표준 기술 현미경에 의해 관찰 될 수 있고, 항체의 사용을 필요로하지 않는다.
- EGFP의 발현 패턴을 결정 :: 형광 해부 현미경으로 전체 유기체의 KASH 마커 (재료의 PDF 참조). 참고 : 그림 1의 REPO-GAL4 드라이버, 전시 N 포함한 많은 인 Gal4 드라이버를예를 들면 침샘과 같은 다른 애벌레 조직에서 표현의 onspecific 패턴 (결과를 참조하십시오).
- 공 초점 현미경을....
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결과
REPO-GAL4 드라이버 (블루밍턴 재고 번호 7415)가 특별히 개발 (18)의 여러 단계에서 초파리 신경계에있는 신경 교세포로 표현된다. 파리 안정적으로 표준 유전자 기술을 사용하여 REPO-GAL4 드라이버의 제어하에 UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 표현이 생성되었다. EGFP의 발현 패턴 :: KASH의 형질 전환이 파리에서의 특성을, 제 령 유충의 해부 눈 엽과 눈, 상상 디스크에서 GFP 발현의 패턴은 공 초점 현미경을 사용하여 조사 하였다. 해부 조직은 광 수용체의 축색 돌기 (mAb24B10 레이블을 DNA와 α-chaoptin (19)를 표시하는 DAPI와 대조했다 ) 자료 PDF를 참조하십시오. 그림 1A는 REPO-GAL4 기반 EGFP가 :: KASH의 유전자가 예상되는 표현 패턴의 광 엽 .......
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토론
이 프로토콜은 Drosophila의 배아 또는 애벌레 조직에서 혼합 된 세포 집단에서 특히 태그 핵을 분리 또는 매우 풍부하게하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 핵은 약 1 시간에 해부 조직으로부터 단리 할 수있다. 고립 된 핵의 순도와 수율은 실험적으로 각 세포 유형에 대해 결정해야합니다. 이 때문에 시료 내에 존재 구슬 혈구를 사용하여 프로토콜의 후 분리 단계에서 비드 바인딩 핵을 정량화하기 어렵다. 핵의 정확한 숫자는 다운 스트림 응용 프로그램에 필요한 경우 따라서, 이러한 DNA 함량 등의 다른 방법에 따라 핵 수익률을 추정 할 필요가있을 것입니다. RNA가 성공적으로 분리되고 정량화 될 수 있다면 핵 수율의 정확한 계산은 유전자 발현 분석을 위해 필요하지 않다. 우리가 발견 한 것처럼 그것은, RNA 수율을 정량화 형광 기반의 방법을 사용하는 것을 권장합니다 RNA 농도의 분광 결정이러한 낮은 농도의 샘플에서 매우 변수입니다.
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리는 UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 플라스미드를 제공하는 제니스 피셔 감사합니다. mAB24B10 항체는 NICHD의 후원하에 개발 된 발달 연구 브리 도마 은행에서 얻은 아이오와 대학 생물학과에 의해 유지되었다. REPO-GAL4 재고 (BL7415)는 인디애나 대학 블루밍턴 증권 센터로부터 얻은 것입니다. 암 연구를위한 퍼듀 대학 센터 미국 암 학회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (IRG # 58-006-53)의 지원은 기꺼이 인정합니다. Jingqun 엄마는 퍼듀 대학에서 식품 및 농업 퍼듀 조교의 농업 연구에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항-chaoptin 항체 (mouse, monoclonal) | Developmental studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP 항체 (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | 이 프로토콜에는 이 특이적 항체를 권장합니다. 그러나, 대체 항체도 사용될 수 있다. |
| ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드 염) | 비오튬 | 40011 | |
| Dounce 균질화기 (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 핀셋, 11 cm | |||
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | 이 특정 브랜드의 마그네틱 비드는 이 프로토콜에 권장됩니다. |
| EpiScript 역전사효소 | 진원지 | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon 세포 여과기, 40 μ m 기공 크기 | VWR | 21008-949 | 표적 세포핵의 크기에 따라 다른 기공 크기를 사용할 수 있습니다. |
| 마그네틱 스탠드 (8 x 1.5 ml 튜브) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| 미니 튜브 로테이터 | Genemate | H-6700 | |
| 큐비트 스타터 키트 | Life Technologies | Q32871 | RNA 수율을 정량화하기 위한 유사한 형광 기반 방법을 사용할 수 있습니다. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | 생명 과학 | 기술AM7010 | RNAs를 비활성화하기 위해 이 시약을 사용하는 것은 선택 사항입니다. |
| RT-PCR 기계 Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| 실리콘화 9웰 유리판 | Hampton Research | HR3-134 | |
| 실체현미경 형광 어댑터(로얄 블루(440-460nm) 여기 + 노란색 장벽 | Nightsea | 이 어댑터를 사용하면 일반적인 해부 현미경(예: Nikon)을 사용하여 GFP 형광을 검사할 수 있습니다. | |
| StereoZoom 현미경 83604 10X 광시야 접안렌즈 및 범용 붐 스탠드 세트 | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol 시약 | , Life Technologies | 15596018 | 주의; 대안적인 RNA 추출 방법을 사용할 수 있습니다. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
참고문헌
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chro....
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재인쇄 및 허가
