Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em> Drosophila</em> Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Summary

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Abstract

Tecidos embrionários e de larvas de Drosophila melanogaster, muitas vezes contêm uma mistura altamente heterogénea de tipos de células, o que pode complicar a análise da expressão dos genes nestes tecidos. Assim, para analisar os perfis de expressão de genes específicos de células a partir de tecidos de Drosophila, pode ser necessário isolar os tipos de células específicas, com elevada pureza e em rendimentos suficientes para aplicações a jusante, tais como o perfil de transcrição e imunoprecipitação da cromatina. No entanto, a morfologia celular irregular em tecidos, tais como o sistema nervoso central, juntamente com a população rara de tipos específicos de células nestes tecidos, pode apresentar desafios para os métodos tradicionais de isolamento de células, tais como por microdissecção laser e células activadas por fluorescência (FACS) . Aqui, uma abordagem alternativa para caracterizar os perfis de expressão de genes específicos de células usando o isolamento com base em afinidade de núcleos marcados, em vez de células intactas, está descrito. Núcleos do c específicoell tipo de interesse são geneticamente marcado com um marcador EGFP localizada envelope nuclear utilizando o sistema de expressão binário Gal4/UAS. Estes núcleos marcaram-EGFP pode ser isolado utilizando anticorpos contra GFP que são acoplados a esferas magnéticas. A abordagem descrita neste protocolo permite o isolamento de núcleos coerente de tipos de células específicas no sistema central nervoso larvas de Drosophila em elevado grau de pureza e em quantidades suficientes para análise de expressão, mesmo quando estes tipos de células compreendem menos de 2% da população total de células na tecido. Esta abordagem pode ser usada para isolar os núcleos a partir de uma ampla variedade de Drosophila embrionárias e tipos de células de larvas usando condutores Gal4 específicas, e podem ser úteis para o isolamento de núcleos a partir dos tipos de células que não são adequados para FACS ou microdissecção a laser.

Introduction

Tecidos de Drosophila, tais como o sistema nervoso central contém uma mistura complexa de tipos de células. Assim, para analisar os perfis de expressão de genes específicos de células a partir de tecidos de Drosophila, que é necessário em primeiro lugar isolar uma população homogénea de células específicas em quantidades suficientes para permitir aplicações a jusante. Os métodos para isolar as células de tecidos intactos incluem microdissecção a laser, e de células activadas por fluorescência (FACS) de células inteiras. Enquanto FACS tem sido usado para isolar as células e os núcleos a partir de embriões de Drosophila e de Caenorhabditis elegans para a expressão do gene e cromatina de perfis ^1-3, FACS e microdissecção laser pode ser difícil de realizar com sucesso em tecidos que contêm tipos de células altamente misturados entre si ou que contêm células com morfologia irregular, tais como os neurónios. Para ultrapassar esta dificuldade, os núcleos, em vez de células podem ser isoladas a partir de tipos de células específicos e utilizado para subsequente gene perfil de expressão. Importante, com base em análise de expressão de mRNA microarray utilizando amostras de RNA nucleares apresenta resultados geralmente comparável à realizada utilizando RNA total ^{4, 5.} Além disso, a análise da expressão de genes usando o RNA nuclear tem sido usado com êxito para estudar a expressão de genes em vários organismos, incluindo C. elegans, Arabidopsis thaliana, de Drosophila, e seres humanos ^{4, 5 2, 3.}

Várias abordagens têm sido recentemente descrita para o isolamento de populações específicas de núcleos marcados a partir de tecidos de Drosophila que são adequados para análise da expressão do gene e / ou da cromatina imunoprecipitação. O isolamento lote de cromatina tecido-específicas para o método de imunoprecipitação (bits-chip) utiliza FACS para isolar núcleos fixos com base na expressão de tipo específico de célula de energia nuclear localizada GFP ^2. Esta abordagem tem sido successfully utilizado para analisar a distribuição de modificações de histonas e factores de transcrição, utilizando a imunoprecipitação da cromatina de núcleos isolados a partir da mesoderme de embriões de Drosophila ^2. No entanto, as abordagens baseadas em FACS pode ser menos adequado para o isolamento de núcleos marcados que constituem apenas uma pequena proporção de uma população mista, devido ao aumento do tempo de classificação necessária para obter números adequados para aplicações a jusante. Para superar estas limitações, vários grupos têm utilizado técnicas de isolamento à base de afinidade para purificar os núcleos, que são marcadas com um epitopo específico de um tipo de célula particular. O isolamento dos núcleos marcados em tipos específicos de células de método (intacto) desenvolvidos para uso em Arabidopsis thaliana, ^{6, 7,} foi recentemente adaptado para uso em Drosophila ^8. Neste método, uma proteína de fusão de envelope nuclear que é um substrato para in vivo biotinilação é coexpressed com a Escherichia coli biotina ligase BirA em tipos específicos de células. Núcleos marcados com biotina podem ser, posteriormente, purificado a partir de populações mistas, utilizando a afinidade de isolamento à base de estreptavidina. Utilizando esta abordagem, os núcleos foram rotulados com sucesso e isolado a partir da mesoderme de embriões de Drosophila, em que uma proteína de fusão de envelope nuclear foi expresso sob o controlo de um potenciador específico para mesoderme ^8. Os autores também geradas proteínas de fusão de envelope nucleares que podem ser expressas em qualquer tipo de células sob o controlo da sequência reguladora GAL4 UAS ^9. Esta abordagem é capaz de isolar rapidamente subconjuntos de núcleos marcados a partir de populações mistas, mas requer três construções transgénicas separadas e podem, portanto, ser inadequada para aplicações genéticas particulares. Recentemente, uma aproximação tem sido descrita na qual SOL (S AD1 e C-84 da ONU) proteínas contendo o domínio que se localizam na membrana interior do envelope nuclear foram etiquetados comas proteínas fluorescentes e expresso sob o controlo do sistema Gal4/UAS ^10. Os núcleos foram isolados na presença de detergente não iónico para remover a membrana externa do envelope nuclear, e de afinidade-purificada utilizando esferas magnéticas acopladas a anticorpos anti-GFP. Esta abordagem foi usada com sucesso para isolar pequenas populações de núcleos marcados de subtipos neuronais específicas no cérebro adulto de Drosophila ^10.

Aqui, um protocolo para o isolamento de núcleos marcados a partir de uma população mista de células a partir de tecido de larvas de Drosophila é descrito. Este método foi desenvolvido de forma independente, mas é semelhante ao método descrito por Henry et al. ¹⁰ Em primeiro lugar, os núcleos foram marcadas com um marcador fluorescente que é expresso apenas em tipos de células específicos em Drosophila melanogaster para facilitar o subsequente isolamento de núcleos marcados a partir de populações mistas usando uma abordagem baseada em afinidade. Para identificar os núcleos,foi utilizado o domínio KASH (K larsicht / D nc-1 / S ino h omology). O domínio KASH é um domínio de transmembrana que se localiza na membrana externa do envelope nuclear, em parte através de interacções com proteínas contendo o domínio SUN dentro do espaço perinuclear ^11. O domínio KASH C-terminal de proteínas, tais como as de Drosophila MSP-300 e Klarsicht ancora estas proteínas para a membrana nuclear externa, ao passo que os seus domínios N-terminais interagir com proteínas do citoesqueleto tais como actina ou microtúbulos no citoplasma ^12-14. As construções foram geradas em que o domínio de Drosophila KASH MSP-300 foi fundido com o terminal C de EGFP, sob o controlo da sequência reguladora GAL4 UAS no vector pUAST ^{attB-15, 16.} Usando a integração específica de sítio phiC31, moscas transgénicas foram geradas em que os UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH transgene foi inserido no locus no cromossoma attP23L ^17. A UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH moscas podem ser cruzadas com moscas que expressam Gal4 o condutor em um tipo particular de células, o que resulta na expressão do alvo de EGFP na membrana nuclear externa no tipo celular de interesse. Núcleos marcados podem então ser purificados a partir de populações de células misturadas, utilizando anticorpos contra GFP acoplados a esferas magnéticas. Nesta abordagem, não é necessária a utilização de detergente não iónico, porque a etiqueta de EGFP está localizada ao lado citoplasmático da membrana nuclear externa, e é, portanto, acessível aos anticorpos.

O protocolo abaixo descrito pode ser utilizado para isolar / enriquecer núcleos marcados com EGFP de tipos específicos de células de Drosophila em tecidos larvais, para quantificar a pureza e o rendimento de núcleos isolados, e para extrair o RNA nuclear apropriado para a transcrição reversa-reacção da polimerase em cadeia quantitativa (qRT -PCR), a análise da expressão do gene. O isolamento e purificação de afinidade-núcleos (excluindo tissue dissecção) pode ser realizada em menos de uma hora. Os resultados são apresentados mostrando que os núcleos da glia podem ser isolados com sucesso a partir do lóbulo óptica das larvas e do olho do disco imaginal, e usado para posterior análise da expressão do gene. Prevê-se que esta abordagem seja útil para o isolamento / enriquecimento de núcleos marcados a partir de tecidos embrionários e de larvas, em que as células alvo constituem menos de 5% da população geral. Todas as ações de Drosophila e plasmídeos gerados por este estudo estão disponíveis a partir dos autores, mediante solicitação.

Protocol

1. Geração e Caracterização de EGFP :: KASH Drosophila Cruz Gal4 motorista voa para UAS-EGFP :: MSP-300 KASH voa. Alternativamente, moscas recombinantes que transportam tanto o condutor de Gal4 e do transgene UAS-EGFP :: MSP-300 KASH pode ser gerada utilizando técnicas genéticas convencionais. Esta segunda abordagem é vantajoso se forem necessárias grandes quantidades de progenitura. Caracterizar a expressão do marcador EGFP …

Representative Results

O controlador de repo-GAL4 (Bloomington número de stock 7415) é expresso especificamente nas células da glia do sistema nervoso Drosophila em vários estágios de desenvolvimento 18. As moscas foram geradas que estavelmente expressam UEA-EGFP :: MSP-300 KASH sob o controlo do controlador de repo-GAL4 utilizando técnicas genéticas convencionais. Para caracterizar o padrão de expressão da EGFP :: KASH transgene nestes moscas, o padrão de expressão da GFP n…

Discussion

Este protocolo pode ser utilizado para isolar ou enriquecer especificamente altamente núcleos marcados a partir de populações de células mistas na Drosophila embrionárias ou tecidos larvais. Usando este protocolo, os núcleos podem ser isoladas a partir de tecidos dissecados em aproximadamente 1 hora. A pureza e o rendimento dos núcleos isolados devem ser determinadas experimentalmente para cada tipo de célula. Pode ser difícil de quantificar os núcleos de talão ligado a na fase de pós-isolamento do …

Materials

Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9 well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L