Affinity основе Выделение Tagged ядер от<em> Дрозофилы</em> Ткани для анализа экспрессии генов
Summary
Drosophila ткани часто содержат гетерогенную смесь типов клеток. Для изучения экспрессии генов в специфические типы клеток из определенной ткани, ядра могут быть генетически помечены и затем выделяют с использованием подхода сродства основе. Изолированных ядер может быть использован для последующих приложений, таких как анализа экспрессии генов и иммунопреципитации хроматина.
Abstract
Дрозофилы эмбриональные и личиночные ткани часто содержат весьма гетерогенную смесь типов клеток, которые могут усложнить анализ экспрессии генов в этих тканях. Таким образом, анализ клеточно-специфический профили экспрессии генов из Drosophila тканей, может быть необходимо изолировать специфические типы клеток с высокой чистотой и выходом на достаточном для последующих приложений, таких как транскрипционный профилирования и иммунопреципитации хроматина. Однако неравномерное клеточной морфологии в тканях, таких как центральной нервной системы, в сочетании с редкой популяции специфических типов клеток в этих тканях, может создавать проблемы для традиционных методов выделения клеток, таких как лазерный микродиссекции и флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS) . Здесь, альтернативный подход к характеризующие профили экспрессии генов клеток конкретных используя изоляцию сродства основе меченых ядер, а не целые клетки, описывается. Ядра в конкретной слокоть тип интереса генетически метили ядерной оболочки локализованные EGFP тега с использованием системы двоичного выражения Gal4/UAS. Эти EGFP-меченый ядра могут быть выделены с использованием антител против GFP, которые соединены с магнитными гранулами. Подход, описанный в данном протоколе обеспечивает последовательное выделение ядер от конкретных типов клеток в Drosophila личинок центральной нервной системы при высокой чистотой и при достаточном уровне для анализа экспрессии, даже если эти типы клеток составляют менее 2% от общего количества клеток в ткани. Этот подход может быть использован для выделения ядра из широкого спектра Drosophila эмбриональных и личиночных типах клеток с использованием специфических драйверов GAL4, и может быть полезна для выделения ядра из типов клеток, которые не подходят для FACS или лазерного микродиссекции.
Introduction
Drosophila тканей, таких как центральной нервной системы содержат сложную смесь типов клеток. Таким образом, анализ клеточно-специфический профили экспрессии генов из Drosophila тканей, в первую очередь необходимо изолировать гомогенной популяции специфических клеток в количествах, достаточных для последующих применений. Методы, позволяющие изолировать клетки от здоровых тканей включают лазерный микродиссекции и флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) целых клеток. В то время как FACS была использована для выделения клеток и ядер из эмбрионов Drosophila и Caenorhabditis Элеганс от для экспрессии генов и хроматина профилирования 1-3, FACS и лазерной микродиссекции может быть трудно успешно выполнить в тканях, которые содержат сильно перемешаны типы клеток или содержащие клетки с нерегулярные морфологии, такие как нейроны. Чтобы преодолеть эту трудность, ядра, а не клетки могут быть выделены из специфических типов клеток и использовали для последующего поколенияе выражение профилирования. Важно отметить, что микрочипов на основе анализа экспрессии мРНК с использованием образцов ядерной РНК показывает, как правило, сравнимые результаты с что выполняется с использованием полной РНК 4, 5. Более того, анализ экспрессии генов с использованием ядерной РНК успешно используется для изучения экспрессии генов в различных организмов, включая С. Элеганс, арабидопсис, дрозофилы, и люди 4, 5 2, 3.
Некоторые подходы были недавно описаны для выделения отдельных групп населения меченых ядер из Drosophila тканей, которые подходят для анализа экспрессии генов и / или иммунопреципитации хроматина. Пакетный изоляция тканеспецифической хроматина для метода иммунопреципитации (BITS-Chip) использует FACS изолировать фиксированных ядер на основе камерного типа специфической экспрессии ядерного локализованные GFP 2. Этот подход был суccessfully используется для анализа распределения модификаций гистонов и транскрипционных факторов с использованием хроматина иммунопреципитацию изолированных ядер из мезодермы эмбрионов Drosophila 2. Тем не менее, подходы СУИМ основе может быть менее пригодны для выделения меченых ядер, которые составляют лишь небольшую долю смешанной популяции в связи с увеличением времени Упорядочить необходимой для получения подходящих номеров для последующих применений. Чтобы преодолеть эти ограничения, несколько групп использовали методы изоляции сродством на основе очистить ядра, которые помечены с конкретным эпитопом в конкретном типе клеток. Выделение ядер отмеченных в специфические типы клеток методом (неповрежденного судна), разработанных для использования в арабидопсис 6, 7 недавно был адаптирован для использования в дрозофилы 8. В этом методе, слияние ядерная оболочка белок, который является субстратом для в естественных условиях биотинилирования является coexpresСЭД с кишечной палочкой биотин-лигазы Бира в специфические типы клеток. Биотин-меченные ядра может быть очищен от смешанных популяций с использованием стрептавидина на основе сродства изоляцию. Используя этот подход, ядер были успешно промаркированы и изолированы от мезодермы дрозофилы эмбрионов, в которых была выражена слитый белок ядерная оболочка под контролем мезодермы конкретных усилитель 8. Авторы также генерируется ядерных белков конверт слияния, которые могут быть выражены на любом типе клеток под контролем регуляторной последовательности Gal4, БАС 9. Этот подход способен быстро выделения подмножества меченых ядер из смешанных популяций, но требует трех отдельных трансгенных конструкции и, следовательно, могут не подходить для определенных генетических приложений. В последнее время подход был описан в котором ВС (S ad1 и ООН С-84) домена, содержащих белки, которые локализуются в внутренней мембране ядерной оболочки были помеченыфлуоресцентные белки и экспрессируется под контролем системы Gal4/UAS 10. Ядра выдел ют в присутствии неионогенного моющего средства для удаления внешней мембраны ядерной оболочки, и аффинно очищают, использу магнитные шарики, соединенные с анти-GFP антител. Этот подход был успешно использован для выделения небольших популяций меченых ядер от конкретных нейронных подтипов внутри взрослом мозге дрозофилы 10.
Здесь, протокол для изоляции меченых ядер из смешанной популяции клеток из ткани Drosophila личинок описан. Этот метод был разработан самостоятельно, но похож на подход, описанный Генри и др.. 10 Во-первых, ядра были помечены флуоресцентным тега, который экспрессируется только в определенных типах клеток в дрозофилы, чтобы облегчить последующую изоляцию отмеченных ядер от смешанным населением используя подход сродства основе. Чтобы пометить ядра,домен KASH (К larsicht / пс-1 / S ин ч omology) был использован. Домен KASH является трансмембранный домен, что локализуется в наружной мембране ядерной оболочки, частично через взаимодействие с ВС домен-содержащих белков внутри перинуклеарном пространстве 11. С-концевой домен KASH из белков, таких как Drosophila MSP-300 и Klarsicht анкеры эти белки с наружной ядерной мембраны, тогда как их N-концевые домены взаимодействуют с цитоскелета белков, таких как актин или микротрубочек в цитоплазме 12-14. Конструкции были получены в котором область KASH из Drosophila MSP-300 был присоединен к С-концу EGFP, под контролем регуляторной последовательности UAS Gal4, в векторе pUAST-attB 15, 16. Использование phiC31 сайт-специфической интеграции, были получены трансгенные мухи, в котором UAS-EGFP :: MSP-300 KASH трансген был вставлен в attP2 локусов на хромосоме3L 17. UAS-EGFP :: MSP-300 KASH летит могут быть скрещены с мухами, которые экспрессируют драйвер Gal4 в конкретном типе клеток, в результате чего целевой экспрессии EGFP на внешней ядерной мембраны в типе клеток, представляющих интерес. Меченых ядер затем может быть очищен из клеточных популяций смешанных с использованием антитела против GFP, соединенных с магнитными гранулами. В этом подходе, использование неионогенного моющего средства не требуется, поскольку тег EGFP локализуется на цитоплазматической стороне внешней ядерной мембраны и, следовательно, для антител.
Протокол, описанный ниже, могут быть использованы для выделения / обогащения EGFP-меченого ядра из специфических типов клеток у дрозофилы личинок тканей, для количественной оценки чистоты и выхода изолированных ядер и извлечь ядерную РНК подходит для количественного обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (Qrt -PCR) анализ экспрессии генов. Выделение и сродство-очистка ядер (исключая Тканье рассечение) может быть выполнена менее чем за один час. Результаты представлены показывающий, что глиальные ядра могут быть успешно выделены из личиночной оптической доли и глаз имагинального диска, и используется для последующего анализа экспрессии генов. Предполагается, что такой подход будет полезен для выделения / обогащения меченых ядер от эмбриональных и личиночных тканей, в которых клетки-мишени составляют менее 5% от общей численности населения. Все запасы Drosophila и плазмиды, полученные в этом исследовании, можно получить у авторов по запросу.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол может быть использован для выделения или сильно обогатить специальные коды ядра от населения смешанных клеток в Drosophila эмбриональных или тканей личинки. Используя этот протокол, ядра могут быть выделены из рассеченных тканей в приблизительно 1 часа. Чистота и выход и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дженис Фишер за предоставление плазмиды UAS-EGFP :: MSP-300 Kash. MAB24B10 антитела были получены от развивающего исследований гибридом банка, разработанных под эгидой NICHD и поддерживается в Университете штата Айова, биологический факультет. Репо-GAL4 складе (BL7415) был получен из фондовой Центра Блумингтон при Университете Индианы. Поддержка со стороны Американского онкологического общества Institutional Research Грант (IRG # 58-006-53) в Университетском центре Пердью по исследованию рака является благодарностью. Jingqun Ма поддерживается в сельскохозяйственных исследований Пердью ассистента в продовольствия и сельского хозяйства в Университете Пердью.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
- Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
- Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
- Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. 유전학. 168, 1385-1393 (2004).
- Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
- Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
- Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).
