Affinitetsbaserade Isolering av Tagged Kärnor från<em> Drosophila</em> Vävnader för Gene Expression Analysis

Summary

Drosophila vävnader innehåller ofta en heterogen blandning av celltyper. För att undersöka genuttryck i specifika celltyper från en viss vävnad, kan kärnan vara genetiskt taggade och därefter isoleras med hjälp av en affinitetsbaserad metod. Enstaka kärnor kan användas för tillämpningar efter exempelvis genuttryck analys och kromatin immunoprecipitation.

Abstract

Drosophila melanogaster embryon och larver vävnader innehåller ofta en mycket heterogen blandning av celltyper, som kan komplicera analysen av genuttryck i dessa vävnader. Således, för att analysera cellspecifika genuttrycksprofilerna från Drosophila vävnader, kan det vara nödvändigt att isolera specifika celltyper med hög renhet och i tillräckliga halter för tillämpningar i senare led, t.ex. transkriptionsprofilering och kromatin immunoprecipitation. Däremot kan den oregelbundna cellulär morfologi i vävnader såsom det centrala nervsystemet, i kombination med den sällsynta populationen av specifika celltyper i dessa vävnader, utgöra utmaningar för traditionella metoder för cellisolering såsom laser microdissection och fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) . Här visas ett alternativt tillvägagångssätt för att karakterisera cellspecifika genuttrycksprofilerna använder affinitetsbaserad isolering av märkta kärnor, snarare än hela celler, beskrivs. Kärnor i den specifika c.ell typ av intresse är genetiskt märkta med en kärnhöljet-lokaliserad EGFP tag hjälp av Gal4/UAS binära expressionssystem. Dessa EGFP-märkta kärnorna kan isoleras med användning av antikroppar mot GFP som är kopplade till magnetiska pärlor. Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll möjliggör konsekvent isolering av kärnor från specifika celltyper i Drosophila larver centrala nervsystemet vid hög renhet och kan i tillräckliga nivåer för expressionsanalys, även när dessa celltyper omfattar mindre än 2% av den totala cellpopulationen i vävnad. Kan användas för detta tillvägagångssätt för att isolera kärnor från ett brett utbud av Drosophila embryonala och larvcelltyper med specifika Gal4 drivrutiner, och kan vara användbara för att isolera kärnor från celltyper som inte är lämpliga för FACS eller laser mikrodissektion.

Introduction

Drosophila vävnader såsom det centrala nervsystemet innehåller en komplex blandning av celltyper. Således, för att analysera cellspecifika genuttrycksprofilerna från Drosophila vävnader, är det först nödvändigt att isolera en homogen population av specifika celler i tillräcklig mängd för att möjliggöra tillämpningar i efterföljande led. Metoder för att isolera celler från intakta vävnader inkluderar laser mikrodissektion, och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av hela celler. Medan FACS har använts för att isolera celler och kärnor från Drosophila embryon och från Caenorhabditis elegans för genexpression och kromatin profilering ^1-3 kan FACS och laser mikrodissektion vara svår att utföra framgångsrikt i vävnader som innehåller starkt blandade celltyper eller som innehåller celler med oregelbunden morfologi, såsom neuroner. För att övervinna denna svårighet kan kärnor hellre än celler isoleras från specifika celltyper och användes för efterföljande allme uttrycksprofilering. Viktigt är microarray-baserad mRNA-expressionsanalys med hjälp av nukleära RNA-prover visar generellt jämförbara resultat som har den utförs med hjälp av total RNA ^{4, 5.} Dessutom har genuttryck analys med användning av nukleära RNA med framgång använts för att studera genuttryck i flera organismer, inklusive C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila och människa ^{4, 5 2, 3.}

Flera metoder har nyligen beskrivits för isolering av specifika populationer av märkta kärnor från Drosophila vävnader som är lämpliga för genuttryck analys och / eller kromatin immunoprecipitation. Sats isolera vävnadsspecifika kromatin för immunoprecipitation (BITS-chip) metod utnyttjar FACS för att isolera fasta kärnor på basis av celltyp specifika uttryck av kärn-lokaliserad GFP ^2. Denna strategi har varit successfully användas för att analysera fördelningen av histon modifieringar och transkriptionsfaktorer som använder kromatin immunoprecipitation av isolerade kärnor från mesoderm av Drosophila embryon ^2. Dock kan FACS-baserade metoder vara mindre lämpad för isolering märkta kärnor som utgör endast en liten del av en blandad befolkning på grund av den ökade sorterings tid som behövs för att få lämpliga siffror för tillämpningar i senare led. För att övervinna dessa begränsningar har flera grupper utnyttjade affinitetsbaserade isoleringstekniker för att rena cellkärnor som är märkta med en specifik epitop i en speciell celltyp. Isoleringen av kärnor etikette i specifika celltyper metoden (intakt) utvecklats för användning i Arabidopsis thaliana ^{6, 7} har nyligen anpassats för användning i Drosophila ^8. I denna metod är en kärnhöljet fusionsprotein som är ett substrat för in vivo-biotinylering coexpresSED med Escherichia coli biotin ligas BirA i specifika celltyper. Biotin-märkta kärnor kan därefter renas från blandade populationer med hjälp av streptavidin-baserade affinitet isolering. Med användning av detta tillvägagångssätt har kärnor framgångsrikt märkta och isoleras från mesoderm av Drosophila embryon, i vilken en kärnhöljet fusionsprotein som uttrycks under kontroll av en mesoderm-specifik enhancer ^8. Författarna genereras också kärnhöljet fusionsproteiner som kan uttryckas i vilken celltyp som helst under kontroll av den Gal4-regulatorisk sekvens, UAS ^9. Detta tillvägagångssätt är i stånd att snabbt isolera delmängder av märkta kärnor från blandade populationer, men kräver tre separata transgena konstrukt och kan därför vara olämplig för vissa genetiska tillämpningar. Nyligen har en metod beskrivits i vilken sön (S AD1-och FN-C-84)-domän-innehållande proteiner som lokaliseras till det inre membranet i kärnhöljet var märkta medfluorescerande proteiner och uttrycktes under kontroll av den Gal4/UAS systemet ^10. Kärnor isolerades i närvaro av icke-jonisk detergent för avlägsnande av det yttre membranet av kärnhöljet, och affinitetsrenades med användning av magnetiska pärlor kopplade till anti-GFP-antikroppar. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att isolera små populationer av märkta kärnor från specifika neuronala subtyper i den vuxna hjärnan i Drosophila ^10.

Här används ett protokoll för isolering av märkta kärnor från en blandad population av celler från Drosophila larv vävnad beskrivas. Denna metod har utvecklats oberoende av varandra, men liknar den metod som beskrivs av Henry et al. ¹⁰ Först var kärnor märkta med en fluorescerande etikett som uttrycks endast i specifika celltyper i Drosophila melanogaster för att underlätta efterföljande isolering av taggade kärnor från blandade populationer med hjälp av en affinitetsbaserad metod. För att märka kärnor,den KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology) domän utnyttjades. Den KASH domän är en transmembrandomän som lokaliserar till det yttre membranet av kärnhöljet, dels genom interaktioner med SUN domän som innehåller proteiner inom det perinukleära utrymmet ^11. Den C-terminala KASH domänen av proteiner såsom Drosophila Msp-300 och Klarsicht förankrar dessa proteiner till den yttre nukleära membranet, medan deras N-terminala domäner interagerar med cytoskelettet proteiner såsom aktin eller mikrotubuli i cytoplasman ^12-14. Konstruktioner som genererades i vilka KASH domänen av Drosophila Msp-300 fuserades till C-terminalen av EGFP, under styrning av Gal4-regulatorisk sekvens, UAS i pUAST-attB-vektor ^{15, 16.} Använda phiC31 sätesspecifik integration, var transgena flugor genereras där UAS-EGFP :: Mspl-300 ^KASH transgen infördes i attP2 loci på kromosom3L ^17. Yrkeshögskolan-EGFP :: Msp-300 ^KASH flugor kan korsas med flugor som uttrycker Gal4 föraren i en viss celltyp, vilket resulterar i den riktade uttrycket av EGFP på den yttre nukleära membranet i celltypen av intresse. Märkta kärnor kan sedan renas från blandade cellpopulationer med användning av antikroppar mot GFP kopplade till magnetiska pärlor. I detta tillvägagångssätt är användningen av nonjonisk detergent inte krävs eftersom EGFP taggen är lokaliserad till den cytoplasmiska sidan av det yttre kärnmembranet, och är därför tillgängliga för antikroppar.

Protokollet som beskrivs nedan kan användas för att isolera / berika EGFP-märkta kärnor från specifika celltyper i Drosophila larver vävnader, för att kvantifiera renhet och utbyte av isolerade kärnor, och att utvinna kärn RNA lämplig för kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (QRT -PCR) genuttrycksanalys. Isoleringen och affinitetsrening av kärnor (exklusive tissue dissektion) kan utföras på mindre än en timme. Resultaten presenteras som visar att glial kärnor kan framgångsrikt isoleras från larvoptiska globen och ögon imaginal skiva, och användes för efterföljande analys av genuttryck. Man räknar med att denna strategi kommer att vara användbart för isolering / anrikning av märkta kärnor från embryonala och larv vävnader i vilka målceller utgör mindre än 5% av den totala befolkningen. Alla Drosophila lager och plasmider från denna studie finns tillgängliga från författarna på begäran.

Protocol

1. Generation och karakterisering av EGFP :: KASH Drosophila Cross Gal4 förare flyger till UAS-EGFP :: Msp-300 KASH flugor. Alternativt kan rekombinanta flugor som bär både Gal4 förare och UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgen genereras med hjälp av vanliga genetiska tekniker. Det andra är en fördel om ett stort antal avkomma krävs. Karaktärisera uttryck av EGFP :: KASH markör med användning av standard mikroskopi tekniker. OBS…

Representative Results

Repo-GAL4 drivrutin (Bloomington lager nummer 7415) är specifikt uttrycks i gliaceller i Drosophila nervsystemet på flera utvecklingsstadier 18. Flugor genererades som stabilt uttrycker UAS-EGFP :: Msp-300 KASH under kontroll av repo-GAL4 förare med vanliga genetiska tekniker. Att karaktärisera expressionsmönstret av EGFP :: KASH transgenen i dessa flugor var mönstret av GFP-uttryck i den dissekerade optiska globen och ögon imaginal skivan från tredje ins…

Discussion

Detta protokoll kan användas för att isolera eller mycket berika specifikt taggade kärnor från blandade cellpopulationer i Drosophila embryonala eller larver vävnader. Med hjälp av detta protokoll, kan kärnor isoleras från dissekerade vävnad i ca 1 timme. Renheten och utbytet av de isolerade kärnor skall bestämmas experimentellt för varje celltyp. Det kan vara svårt att kvantifiera de pärlbundna kärnor vid den post-isolering skede av protokoll med användning av en hemocytometer grund av pärlorn…

Materials

Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9 well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L