Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em> Drosophila</emGen ekspresyon analizi için> Dokular
Summary
Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.
Abstract
Drosophila melanogaster embriyonik ve larva dokular genellikle bu dokularda gen ekspresyon analizi karmaşık hücre türleri arasında yüksek ölçüde heterojen bir karışımı içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, yüksek saflıkta ve bu transkripsiyon profil ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için yeterli bir verimde özel hücre tiplerini izole etmek için gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu dokularda spesifik hücre tipleri nadir nüfusu ile birleştiğinde örneğin merkezi sinir sistemi gibi dokularda düzensiz hücre morfolojisi, ayırma lazer mikro-kesim ve floresans ile aktive edilmiş hücre gibi hücre izolasyonu için geleneksel yöntemlerle (FACS) zorluklar oluşturabilir . Burada, etiketlenmiş çekirdeklerin afinite bazlı izolasyon yerine, tüm hücreleri kullanılarak hücre spesifik gen ekspresyon profillerini karakterize için alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Belirli c çekirdeklerilgi ell tür genetik olarak Gal4/UAS ikili sentezleme sistemi kullanılarak bir çekirdek zarı-lokalize EGFP etiket ile etiketlenir. Bu EGFP-etiketli çekirdekleri manyetik boncuklara bağlanmış olan GFP karşı antikorlar kullanılarak izole edilebilir. Bu protokol açıklanan yaklaşım, bu hücre tipleri, toplam hücre popülasyonunun en az% 2 edilmiş olsa dahi, yüksek saflıkta Drosophila larva, merkezi sinir sisteminde ve ekspresyon analizi için yeterli seviyelerde özel hücre tiplerinden çekirdeklerinin tutarlı izolasyonu sağlar doku. Bu yaklaşım, Drosophila embriyonik ve belirli Gal4 sürücüleri kullanarak larva hücre tipleri çok çeşitli çekirdek izole etmek için kullanılabilir, ve FACS veya lazer mikro-kesim için uygun değildir hücre tiplerinden olan çekirdek izole edilmesi için faydalı olabilir.
Introduction
Gibi, merkezi sinir sistemi gibi dokularda Drosophila hücre tipleri karmaşık bir karışımını içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, bu alt uygulamaları sağlamak için yeterli miktarlarda spesifik hücrelere homojen bir popülasyonu izole etmek için ilk olarak gereklidir. Dokulara hücreleri izole etmek için yöntemler lazer mikrodiseksiyon ve bütün hücre sınıflandırması (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre içerir. FACS 1-3 gen ekspresyonu ve kromatin için Drosophila embriyolardan ve Caenorhabditis elegans hücreler ve çekirdekler izole etmek için kullanılmış olsa da, FACS ve lazer mikrodiseksiyon yüksek harmanlanmış hücre tipleri ya da içeren hücreler ile birlikte içeren dokularda başarılı bir şekilde gerçekleştirmek zor olabilir nöronlar gibi düzensiz morfolojisi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, çok hücrelere göre çekirdek, özel hücre tipleri izole edilmiştir ve daha sonra gen için kullanılabilire ekspresyon profili. Önemli olarak, nükleer RNA numuneleri kullanılarak mikro-dizi-bazlı mRNA ifadesi analiz, toplam RNA 4, 5 kullanılarak gerçekleştirilmiştir genel olarak benzer sonuçlar göstermektedir. Ayrıca, nükleer RNA kullanılarak gen ekspresyon analizi başarılı bir şekilde C de dahil olmak üzere bir çok mikroorganizma gen ifadesini incelemek için kullanılmıştır elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila ve insanlar 4, 5, 2, 3.
Yakın zamanda çeşitli yaklaşımlar gen ekspresyon analizi ve / veya kromatin immüno için uygun olan Drosophila dokulardan etiketli çekirdeklerinin özel popülasyonlarının izole edilmesi için anlatılmıştır. Immünopresipitasyon (bit çipli) yöntemi için dokuya özel kromatin toplu izolasyonu nükleer lokalize GFP 2'nin hücre türüne özgü ifade bazında sabit bir çekirdek izole etmek için FACS kullanır. Bu yaklaşım, su olmuşturccessfully Drosophila embriyoların 2'nin mezodermden izole edilmiş çekirdeklerin Kromatin immüno-çökeltmesi kullanılarak histon modifikasyon ve transkripsiyon faktörlerinin dağılımı analiz etmek için kullanılır. Bununla birlikte, FACS-bazlı yaklaşımlar nedeniyle alt uygulamalar için uygun numaraları elde etmek için gerekli olan yüksek sıralama zaman bir karışık nüfusun sadece küçük bir kısmını oluşturan etiketli çekirdek izole edilmesi için daha az uygun olabilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, birkaç grup özel bir hücre tipinde belirli bir epitop ile etiketlenir çekirdek saflaştırılması için afinite bazlı izolasyon teknikleri kullandık. Arabidopsis thaliana 6, 7 kullanılmak için geliştirilmiş, özel hücre tipleri (bozulmamış) yöntemi etiketli çekirdeklerin son izolasyonu Drosophila 8 kullanılmak üzere adapte edilmiştir. Bu yöntemde, in vivo biyotinilasyon için bir substrat olan bir çekirdek zarı füzyon proteini olup coexpresspesifik hücre tiplerinde Escherichia coli biotin ligazı BirA ile sed. Biotin-etiketli çekirdekler ardından streptavidin bazlı afinite izolasyonu kullanarak karışık popülasyonlardan saflaştırılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, çekirdek çekirdek zarı başarılı bir füzyon proteini, bir mezoderm özgü arttırıcı 8 kontrolü altında eksprese edildiği, Drosophila embriyoların mezodermden etiketlenmiş ve izole edilmiştir. Yazarlar ayrıca, Gal4 düzenleyici dizi, UAS 9 kontrolü altında, herhangi bir hücre tipinde ifade edilebilir çekirdek zarı füzyon proteinlerini oluşturulur. Bu yaklaşım, hızlı bir şekilde karışık nüfusu etiketli çekirdeklerinin alt kümelerini izole edilmesi yeteneğine sahiptir, ama üç farklı transjenik yapıları gerektirir ve bu nedenle de, özellikle genetik uygulamalar için uygun olabilir. Son zamanlarda, bir yaklaşım SUN (S AD1 ve UN C-84), nükleer zarfın iç zarına lokalize etki alanı içeren proteinler ile etiketlendi edildiği tarif edilmiştirfloresan proteinleri ve Gal4/UAS sisteminin 10 kontrolü altında ifade edilmiştir. Çekirdekler nükleer zarfın dış zar kaldırmak için iyonik olmayan deterjanın varlığında, izole edilir ve anti-GFP antikorları bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak afiniteyle saflaştırıldı. Bu yaklaşım, Drosophila 10 yetişkin beyin içinde spesifik sinir hücresi alt tiplerinin etiketli çekirdeklerin küçük popülasyonlarının izole edilmesi için kullanılmıştır.
Burada, Drosophila larva dokudan hücrelerin karışık bir nüfusu etiketli çekirdeklerin izolasyonu için bir protokolü tarif edilmektedir. Bu yöntem, bağımsız bir şekilde, geliştirilmiş, ancak Henry vd. 10 Birinci tarafından açıklanan yaklaşım benzer olan, çekirdek karışık popülasyonlarında etiketli çekirdeklerin daha sonra izole edilmesini kolaylaştırmak için, sadece Drosophila melanogaster, spesifik hücre tiplerinde ifade edilen bir floresan etiket ile etiketlenmiş afinite-temelli bir yaklaşım kullanarak. Çekirdekler etiketlemek için,KASH (K larsicht / A nc-1 / S yne h omology) etki kullanılmıştır. KASH etki perinükleer alanı 11 içinde SUN etki alanı içeren proteinleri ile etkileşim yoluyla kısmen nükleer zarfın dış membran, lokalize bir transmembran etki alanıdır. Bunların N-terminal etki alanları, örneğin sitoplazma içinde 12-14, aktin ya da mikro tüpler gibi hücre iskeleti proteinleri ile etkileşim sırasında Drosophila Msp-300 ve Klarsicht gibi proteinlerin C-terminal KASH etki, dış nükleer membran proteinleri için, bu tutturur. Konstruktlar hangi Drosophila Msp-300 KASH etki pUAST-attB vektörü 15, 16 'de Gal4 düzenleyici dizi, UAS kontrolü altında, EGFP C-terminine kaynaştırılmıştır üretilmiştir. PhiC31 siteye özgü entegrasyon kullanılarak, transjenik sinekler oluşturulan UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgen kromozomu üzerindeki attP2 lokus olarak sokulmuştur hangi3L 17. UAS-EGFP :: Msp-300 KASH uçan, ilgi konusu bir hücre tipinde dış çekirdek zar üzerinde EGFP hedeflenen eksprese edilmesine yol açan, özel bir hücre tipinde ifade Gal4 sürücü sinek ile çaprazlanabilir. Etiketli çekirdekleri daha sonra manyetik boncuklara bağlanmış GFP karşı antikorlar kullanarak karışık hücre popülasyonlarından saflaştırılabilir. Bu yaklaşımda, iyonik olmayan deterjanın kullanımı EGFP etiket dış çekirdek zarının sitoplazmik yanı lokalize olduğu için gerekli olan ve bu nedenle, antikorlar için erişilebilir değildir.
Aşağıda tarif edilen protokol saflık ve izole edilmiş verimi çekirdeklerin ölçmek için, Drosophila larva dokularda spesifik hücre tiplerinden EGFP etiketli çekirdek zenginleştirmek / izole etmek ve (kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için uygun nükleer RNA çıkarmak için kullanılabilir qRT -PCR) gen ekspresyon analizi. Çekirdeklerin izolasyonu ve afiniteyle saflaştırma (tissu hariçdiseksiyon e) en az bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Sonuçlar glial çekirdekleri başarıyla larva optik lob ve göz hayali diskten izole edilir ve daha sonra gen ekspresyon analizi için kullanılabileceğini gösteren sunulmaktadır. Bu yaklaşım, hedef hücreler, genel nüfusun% 5'ten az teşkil eden embriyonik ve larva dokularından etiketli çekirdeklerin izolasyon / zenginleştirilmesi için yararlı olacağı tahmin edilmektedir. Bu çalışmada oluşturulan tüm Drosophila hisse senetleri ve plazmalar istek üzerine yazarlarda mevcuttur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Drosophila embriyonik ya da larva dokularda karma hücre popülasyonlarından, özellikle etiketli ya da yüksek ölçüde çekirdek izole zenginleştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü kullanarak, çekirdekler, yaklaşık 1 saat içinde kesilmiş dokularından izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdeklerin saflığı ve verimi deneysel her hücre tipi için belirlenmelidir. Çünkü numunede mevcut boncukların hemasitometre kullanarak protokol sonrası izolasyon aşamasında boncuk-bağl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz UAS-EGFP :: Msp-300 KASH plazmid sağlamak için Janice Fischer teşekkür ederim. MAB24B10 antikor NICHD himayesinde geliştirilen Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü tarafından muhafaza edilmiştir. Repo-GAL4 stok (BL7415) Indiana Üniversitesi Bloomington Stok Merkezinden elde edilmiştir. Kanser Araştırma Purdue University Center Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG # 58-006-53) den destek minnettarlıkla olduğunu. Jingqun Ma Purdue Üniversitesi'nde Gıda ve Tarım Purdue ASİSTANLIĞA bir Tarımsal Araştırma tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
- Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
- Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
- Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. 유전학. 168, 1385-1393 (2004).
- Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
- Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
- Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).
