Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen
Summary
Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
Einzelmolekül (SM)-Techniken haben sich in den letzten dreißig Jahren entwickelt, um auf die Notwendigkeit der Überwindung einiger der Grenzen der traditionellen, Groß Lösung Messungen 1-3 reagieren. Die Manipulation von einzelnen biologischen Molekülen hat die Möglichkeit, die mechanischen Eigenschaften von Biopolymeren 4 messen und steuern die mechanischen Parameter der Protein-Protein-und Protein-5-DNA-Wechselwirkungen 6,7 erstellt. SM Fluoreszenz-Detektion auf der anderen Seite stellt ein extrem vielseitiges Werkzeug für die Untersuchung der Proteinaktivität in vitro und in vivo, was zu der Möglichkeit der Lokalisierung und Verfolgung einzelner Moleküle mit Nanometer-Präzision. Durch Einpassen des Instruments Point-Spread-Funktion auf die SM Bild in der Tat kann man die Lokalisierung mit einer Genauigkeit hauptsächlich in Abhängigkeit von Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) und dem Erreichen einer Grenze von etwa einem Nanometer 8,9 zu erreichen. Diese Methoden finden leistungsstarkenAnwendungen in der Untersuchung der Dynamik von Motorproteinen, sowie der Zielsuche in der DNA-bindenden Proteinen zugrunde liegenden Diffusionsprozesse. Die Fähigkeit zur Bestimmung Diffusionskonstanten als Funktion der DNA-Sequenz, die Verweilzeit auf dem Ziel und genauen Messen der DNA-Länge während der eindimensionalen Diffusions Ereignisse erforscht sind, ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktion Dynamik und zur Untersuchung der Mechanismen der spezifischen Zielsuche.
Vor kurzem hat die Kombination dieser beiden Techniken eine neue Generation von experimentellen Aufbauten 10-14 ermöglicht die gleichzeitige Manipulation einer biologischen Substrats (zum Beispiel eine Aktin-Filament oder ein DNA-Molekül) und Detektion / Lokalisierung eines interagierenden Partner-Enzym (beispielsweise hergestellt Myosin oder ein DNA-bindendes Protein). Die Vorteile dieser Technik liegen vor allem auf die Möglichkeit der Ausübung mechanischer Kontrolle über die eingefangene Polymer, wodurch ENAbling das Studium der Wechselwirkung Dynamik gegenüber Kräfte oder Drehmomente. Auch ermöglicht die Methodologie Messen biochemischer Reaktionen weit von der Oberfläche, die Vermeidung eines der wichtigsten Einschränkungen der klassischen SM Methoden, also die Notwendigkeit einer Immobilisierung der untersuchten Moleküle auf einer Oberfläche (Glasobjektträger oder Mikrokügelchen).
Die Kombination von zwei einzelnen Molekülen Techniken erfordert Überwindung mehrere technische Schwierigkeiten, vor allem die aus den Anforderungen der mechanischen Stabilität und angemessene SNR 15 (vor allem, wenn die Lokalisierung mit nm Präzision erfordern). Insbesondere dann, wenn die Kopplung SM Fluoreszenzdetektion mit optischen Pinzetten, die Reduzierung von Lärm und die Photobleichung von den Fang Infrarot-Laser 16 und der Kontrolle der biochemischen Puffer für die Montage der biologischen Komplexen und die Leistung der experimentellen Messungen 11 sind von größter Bedeutung. Hier beschreiben wir die Verfahren für erfolgreicheMessungen in einem Dual-Trapping / SM Fluoreszenz-Lokalisierung-Setup. Die Methode ist mit dem Beispiel der Lactose-Repressor-Protein (LacI) fluoreszierend (bei Atto532) markiert und nachgewiesen, wie es ein DNA-Molekül (zwischen zwei optischen Pinzette bewegt) bindet LacI mit spezifischen Bindungssequenzen (dh Betreiber) dargestellt. Wir zeigen die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Detektion der Bindung an DNA und LacI Diffusion entlang ihrer Kontur in der Zielsuchvorgang. Das Verfahren ist auf jede Kombination von DNA-Sequenz und DNA-bindendes Protein als auch an andere Systeme (Mikrotubuli oder Aktinfilamente und der Motor-Proteine interagieren mit ihnen).
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten zehn Jahren haben Einzelmolekülmanipulation und bildgebenden Verfahren große Fortschritte in Bezug auf die räumliche und zeitliche Auflösung zu sehen. Die Kombination der Manipulation und bildgebenden Verfahren ist an der Basis wirksame Instrumente, die nun die Steuerung der mechanischen Bedingungen einer einzelnen biologischen Polymeren wie DNA, RNA oder Zytoskelett-Filamente zu ermöglichen, und der gleichzeitigen Lokalisierung von einzelnen Proteinen in Wechselwirkung mit dem gleichen Polymer . Ste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Gijs wuite, Erwin JG Peterman, und Peter Gross für die Hilfe bei der Mikrofluidik und Alessia Tempestini für die Hilfe bei der Probenvorbereitung. Diese Forschung wurde von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung finanziert n ° 284464 und des italienischen Ministeriums für Bildung, Universität und Forschung FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, und im Rahmen der das Vorzeigeprojekt NANOMAX.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
