Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA
Summary
Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
Tecniche di singola molecola (SM) hanno notevolmente sviluppato nel corso degli ultimi trenta anni per rispondere alla necessità di superare alcune delle limitazioni delle tradizionali, alla rinfusa misure soluzione 1-3. La manipolazione di molecole biologiche singoli ha creato la possibilità di misurare le proprietà meccaniche dei biopolimeri 4 e controllare i parametri meccanici di proteina-proteina 5 e le interazioni proteina-DNA 6,7. Fluorescenza SM, dall'altro, rappresenta uno strumento estremamente versatile per studiare l'attività della proteina in vitro e in vivo, che conduce alla possibilità di localizzazione e inseguimento singole molecole con precisione nanometrica. Attraverso il montaggio del punto-spread-funzione strumento all'immagine SM, infatti, si può realizzare localizzazione con precisione in funzione principalmente segnale-rumore (SNR) e raggiungere un limite di circa un nanometro 8,9. Queste metodologie trovano potenteapplicazioni nello studio della dinamica delle proteine motrici, nonché dei processi di diffusione sottostanti ricerche bersaglio di proteine che legano il DNA. La capacità di determinare costanti di diffusione in funzione della sequenza di DNA, tempo di permanenza sul bersaglio e con precisione la misurazione della lunghezza del DNA esplorato durante gli eventi di diffusione monodimensionali, rappresentano un potente strumento per lo studio di interazioni proteina-DNA dinamiche di interazione e per la verifica dei meccanismi di specifica destinazione della ricerca.
Recentemente, la combinazione di queste due tecniche ha prodotto una nuova generazione di apparati sperimentali 10-14 consentano la manipolazione simultanea di un substrato biologico (per esempio un filamento di actina o una molecola di DNA) e rilevamento / localizzazione di un partner interagenti enzima (per esempio miosina o una proteina di legame al DNA). I vantaggi di queste tecniche poggiano principalmente sulla possibilità di esercitare un controllo meccanico sul polimero intrappolato, così enabling lo studio delle dinamiche di interazione rispetto a forze o coppie. Inoltre, il metodo consente di misurare le reazioni biochimiche lontano dalla superficie, evitando una delle principali limitazioni dei metodi classici SM, cioè, la necessità di immobilizzazione delle molecole in esame su una superficie (vetrino o microsfere).
La combinazione di due molecole singole tecniche è necessario superare diverse difficoltà tecniche, derivanti principalmente dai requisiti di stabilità meccanica e adeguata SNR (specialmente quando richiede la localizzazione con precisione nm) 15. In particolare, in caso di allacciamento di rilevamento della fluorescenza SM con pinzette ottiche, la riduzione del rumore e photobleaching da intrappolamento laser a infrarossi 16 e il controllo di buffer biochimici per l'assemblaggio dei complessi biologici e le prestazioni delle misure sperimentali 11 sono di fondamentale importanza. Qui, descriviamo i metodi per l'esecuzione di successomisurazioni in una configurazione a doppio localizzazione cattura / SM fluorescenza. La metodologia è illustrata con l'esempio della proteina repressore lattosio (LacI) fluorescente (con Atto532) e rilevato come si lega ad una molecola di DNA (intrappolato tra due pinzette ottiche) contenente specifiche sequenze di legame Laci (ad esempio, operatori). Abbiamo dimostrato l'efficacia del metodo di rilevazione di legame al DNA di LacI e diffusione lungo il suo profilo nel processo di ricerca di destinazione. Il metodo è applicabile a qualsiasi combinazione di sequenze di DNA e proteine di legame al DNA, come pure ad altri sistemi (microtubuli o filamenti di actina e le proteine motrici che interagiscono con essi).
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi dieci anni, le tecniche di manipolazione e di imaging singole molecole hanno visto grandi progressi in termini di risoluzione spaziale e temporale. La combinazione di tecniche di manipolazione e di imaging è alla base di strumenti potenti che ora permettono il controllo delle condizioni meccaniche di un singolo polimero biologico, come DNA, RNA o filamenti del citoscheletro, e la localizzazione simultanea di singole proteine interagenti con lo stesso polimero . Controllare le condizioni meccaniche de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross aiuto per la microfluidica e Alessia Tempestini di aiuto per la preparazione del campione. Questa ricerca è stata finanziata dal Settimo programma quadro dell'Unione europea (7 ° PQ / 2007-2013), contratto di sovvenzione n ° 284.464 e dal Ministero italiano dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e nel quadro di il Flagship Progetto NANOMAX.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
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