단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합
Summary
여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
단일 분자 (SM) 기술은 크게 전통적인 벌크 용액 측정 1-3의 한계 중 일부를 극복하는 요구에 응답하기 위해 지난 30 년에 걸쳐 개발했다. 단일 생체 분자의 조작은 생체 고분자 (4)의 기계적 특성을 측정하고 단백질 – 단백질 5 및 단백질-DNA 상호 작용의 6,7 기계적 매개 변수를 제어 할 수있는 기회를 만들었다. SM 형광 검출은, 반면에, 로컬 화 및 나노 미터 정밀도로 단일 분자의 추적 가능성 선도, 시험 관내 및 생체 내에서의 단백질의 활성을 연구하는데 대단히 다용도 공구를 나타낸다. SM 이미지에 악기 점 – 확산 함수의 피팅을 통하여, 실제로, 한 정밀도가 신호 대 잡음비 (SNR)에 주로 의존 약 1 나노 미터 8,9의 한계에 도달하여 지역화를 달성 할 수있다. 이 방법은 강력한 찾기모터 단백질의 역학 연구에서 애플리케이션과의 DNA-결합 단백질의 검색 대상을 기초 확산 과정. 대상의 DNA 서열의 기능, 체류 시간으로 확산 상수를 결정하고 정확하게 일차원 확산 이벤트 동안 탐구 DNA 길이를 측정하는 기능, 단백질-DNA 상호 작용의 역학 연구 및 조사를위한 강력한 도구를 대표 특정 대상 검색의 메커니즘.
최근, 이들 두 기술의 조합은 예를 들어 (예를 들어 액틴 필라멘트 또는 DNA 분자) 상호 작용 파트너 효소 및 검출 / 지역화 생물학적 기판의 동시 조작을 가능하게 실험 셋업 10-14의 새로운 세대 (만들어 내고 미오신 또는 DNA-결합 단백질). 이러한 기술의 이점은 주로 ENA 따라서, 포획 된 중합체 위에 기계적 제어를 발휘할 수있는 가능성에 휴식힘 또는 토크 대 상호 작용의 역학 연구를 블링. 또, 방법론은 고전 SM 방법, 즉, 표면에 연구중인 분자의 고정화를위한 필요성 (유리 슬라이드 또는 마이크로 스피어)의 주요 제한을 피하면서 표면으로부터 멀리 생화학 반응을 측정 할 수있다.
두 개의 단일 분자 기술의 조합은 주로 기계적 안정성 및 15 (특히 나노 미터 정밀도로 현지화를 요구하는) 적절한 SNR의 요구 사항에서 발생하는 여러 가지 기술적 인 어려움을 극복해야합니다. 광 핀셋, 노이즈 감소 SM 형광 검출을 결합하고 포착 적외선 레이저 (16) 및 생물학적 착체의 조립 및 실험적 측정 (11)의 성능에 대한 생화학 버퍼로부터 photobleaching에 제어 할 때 특히, 매우 중요하다. 여기서는 성공한 행하는 방법을 설명이중 트래핑 / SM 형광 지역화 설정에서 측정. 방법론은 특정의 lacI 결합 서열 (즉, 오퍼레이터)을 함유 유당 리프레 서 단백질 (의 lacI) 형광 (Atto532로) 분류하고 (2 개의 광 핀셋 사이에 갇혀) DNA 분자에 결합으로서 검출의 예와 함께 도시되어있다. 우리는 목표 탐색 과정에서의 형상을 따라 DNA 및 확산의 lacI의 결합 검출에있어서의 효과를 보여준다. 상기 방법은 DNA 서열 및 DNA-결합 단백질의 임의의 조합뿐만 아니라 다른 시스템 (미세 소관 또는 액틴 필라멘트 및 그들과 상호 작용하는 단백질 모터)에 적용 가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 10 년 동안 단일 분자 조작 및 이미징 기술은 공간과 시간 해상도 측면에서 큰 진전을 보았다. 조작 및 이미징 기법의 조합은 지금 같은 DNA, RNA 또는 세포 골격의 필라멘트와 같은 하나의 생물학적 고분자의 기계적 상태의 제어를 가능하게 강력한 기기의베이스와 같은 중합체와 상호 작용하는 단일 단백질의 동시 위치 파악에 있어요 . 포획 된 중합체의 기계적 조건을 제어하는 것이 특히…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 샘플 준비에 대한 도움말 미세 유체 및 알레 Tempestini에 대한 도움말 Gijs Wuite, 어윈 JG 피터 맨, 피터 그로스 감사합니다. 이 연구는 N 284464을 °와 Ricerca 2013 RBFR13V4M2 교육, 대학 및 연구 FIRB 2011 RBAP11X42L006, FUTURO의 이탈리아어 자원부에서, 그리고 프레임 워크에 부여 계약에 따라 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2,007에서 2,013 사이)에 의해 투자되었다 주요 프로젝트 NANOMAX.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
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