Kombinere Single-molekyl Manipulasjon og bildebehandling for studier av protein-DNA interaksjoner
Summary
Her beskriver vi instrumentering og fremgangsmåter for påvisning av enkelt fluorescensmerket-merkede proteinmolekylene vekselvirker med et enkelt DNA-molekyl opphengt mellom to optisk fangede mikrosfærer.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
Enkelt molekyl (SM) teknikker har i stor grad utviklet seg over de siste tretti årene til å svare på behovet for å overvinne noen av de tradisjonelle begrensningene, bulk løsningsmålinger 1-3. Manipulering av enkelt biologiske molekyler har skapt muligheten for å måle mekaniske egenskaper av biopolymerer 4 og styre de mekaniske parametre for protein-protein 5 og protein-DNA-interaksjoner 6,7. SM fluorescensdeteksjon, på den annen side, representerer en meget allsidig verktøy for å studere protein-aktivitet in vitro og in vivo, noe som fører til muligheten for å lokalisere og spore enkle molekyler med nanometerpresisjon. Ved montering av instrumentet punkt-spredning-funksjon til SM-bilde, i Faktisk kan man oppnå lokalisering med en nøyaktighet avhengig hovedsakelig av signal-til-støy-forhold (SNR) og nådde en grense på omtrent en 8,9 nanometer. Disse metoder finne kraftiganvendelser innen studiet av dynamikken i motorproteiner, så vel som av de diffusjonsprosesser liggende søk target i DNA-bindende proteiner. Evnen til å bestemme diffusjon konstanter som en funksjon av DNA-sekvensen, oppholdstid på målet og nøyaktig måling av DNA-lengde undersøkt i løpet av en-dimensjonale diffusjon hendelser, representerer et kraftig verktøy for studium av protein-DNA interaksjon dynamikk og for undersøkelsen av mekanismene for bestemt mål søk.
Nylig har en kombinasjon av disse to teknikkene ga en ny generasjon av forsøksoppsett 10 til 14 slik at den samtidige bruk av et biologisk substrat (for eksempel et aktin filament eller et DNA-molekyl), og deteksjon / lokalisering av et samspill partner enzym (f.eks myosin eller et DNA-bindende protein). Fordelene med disse teknikkene hovedsakelig hvile på muligheten for å utøve mekanisk kontroll over fanget polymer, således enabling studiet av interaksjons dynamikk versus styrker eller momentene. Dessuten lar den metodikk måling av biokjemiske reaksjoner langt fra overflaten, å unngå en av de viktigste begrensninger av klassiske SM metoder, dvs. behovet for immobilisering av molekyler som ble studert på et underlag (glass-slide eller mikrokuler).
Kombinasjonen av to enkle molekyler teknikker krever overvinne flere tekniske vanskeligheter, først og fremst som følge av kravene til mekanisk stabilitet og tilstrekkelig SNR (spesielt når krever lokalisering med presisjon nm) 15. Spesielt når du kombinerer SM fluorescensdeteksjon med optiske pinsetter, reduksjon av støy og fotobleking fra fangst infrarøde lasere 16 og kontroll av biokjemiske buffere for montering av de biologiske komplekser og ytelsen til de eksperimentelle målingene 11 er av avgjørende betydning. Her beskriver vi metoder for å utføre vellykkedemålinger i en dobbel fangst / SM Fluorescence lokalisering oppsett. Metodikken er illustrert med eksempel på laktose repressor protein (Laci) fluorescensmerkede (med Atto532) og oppdaget da det binder seg til et DNA-molekyl (fanget mellom to optiske pinsett) inneholder spesifikke Laci bindende sekvenser (dvs. operatører). Vi viser effektiviteten av fremgangsmåten for å påvise binding av laci til DNA og diffusjon langs sin kontur i målet søkeprosessen. Fremgangsmåten er anvendbar til en hvilken som helst kombinasjon av DNA-sekvensen og DNA-bindende proteiner, så vel som til andre systemer (mikrotubuli eller actin filamenter, og motoren proteiner som vekselvirker med dem).
Protocol
Representative Results
Discussion
I det siste tiåret, har enkelt molekyl manipulasjon og bildeteknikker sett stor fremgang når det gjelder romlig og tidsmessig oppløsning. Kombinasjonen av manipulasjon og avbildningsteknikker er på bunnen av kraftige instrumenter som nå tillater kontroll av de mekaniske betingelsene for en enkelt biologisk polymer, slik som DNA, RNA eller cytoskeletal filamenter, og den samtidige lokalisering av enkle proteiner i samspill med den samme polymeren . Styre de mekaniske betingelsene for den innfangede polymeren er av s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gijs wuite, Erwin JG Peterman, og Peter Gross etter hjelp med MicroFluidics og Alessia Tempestini for hjelp med prøveopparbeidelse. Denne forskningen ble finansiert av EU sjuende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskuddsavtalen n ° 284464 og fra det italienske departementet for utdanning, Universitetet og forsknings FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro i Ricerca 2013 RBFR13V4M2, og innenfor rammen av Flaggskip Prosjekt NANOMAX.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
