ביטוי וטיהור של רגולטור פיברוזיס הטרנסממברני סיסטיק המוליכות (CFTR) Heterologous אתגרים משמעותיים וגורמים מגבילים בפיתוח הטיפולים תרופתיים לסיסטיק פיברוזיס. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לבידוד של כמויות מיליגרם של CFTR מתאימות ללימודים תפקודיים ומבניים.
פגמים ברגולטור פיברוזיס המוליכות הטרנסממברני פיברוזיס (CFTR) חלבון גורמים סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה אוטוזומלית רצסיבית שכרגע מגבילה את תוחלת החיים הממוצעת של חולים ל< 40 שנים של גיל. הפיתוח של מולקולות תרופה חדשניות כדי לשחזר את הפעילות של CFTR הוא מטרה חשובה בטיפול CF, והבידוד של CFTR תפקודי הפעיל הוא צעד שימושי להשגת מטרה זו.
אנו מתארים שתי שיטות לטיהור של CFTR ממערכת אוקריוטים Heterologous ביטוי, ש ' cerevisiae. כמו מערכות פרוקריוטים, ש ' cerevisiae ניתן לגדל במהירות במעבדה בעלות נמוכה, אלא גם תנועה וposttranslationally יכול לשנות את החלבונים בממברנה גדולים. הבחירה של חומרי ניקוי לsolubilization וטיהור היא שלב קריטי בטיהור של כל חלבון בממברנה. לאחר שהוקרן למסיסות של CFTR בכמה חומרי ניקוי, בחרנו שני שיתוףntrasting חומרי ניקוי לשימוש בטיהור שתאפשר הכנת CFTR הסופית להיות מותאמת לניסויים המתוכננים בהמשך.
בשיטה זו, אנו מספקים השוואה של הטיהור של CFTR בdodecyl-β-D-maltoside (DDM) ו1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1'-RAC-גליצרול) (גפ"מ-14). החלבון מטוהר בDDM בשיטה זו מעיד על פעילות ATPase במבחנים תפקודיים. החלבון מטוהר בגפ"מ-14 תערוכות טוהר גבוה ותשואה, יכולים להיות מועסק על מנת ללמוד שלאחר translational שינויים, ויכול לשמש לשיטות מבניות כגון פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה ומיקרוסקופים אלקטרונים. עם זאת הוא מציג פעילות ATPase נמוכה באופן משמעותי.
סיסטיק פיברוזיס (CF) הוא המחלה הגנטית הנפוצה ביותר באירופה ובצפון אמריקה עם שכיחות של 1 ל 2,500 לידה חי. CF מתרחש כאשר מוטציות ברגולטור פיברוזיס המוליכות הטרנסממברני פיברוזיס (CFTR) הפסד סיבת חלבון של תפקודו בקרום הפלזמה של תאי האפיתל 1. התוצאה החמורה ביותר של פגם זה היא נזק בלתי הפיך ריאות, מה שמקצר את תוחלת החיים של חולים ל< 40 גיל 2,3.
CFTR הוא קלטת ATP מחייב טרנספורטר (ABC) שהתפתחה להיות 1,4 ערוץ יון. למרות הפונקציה די שינתה בקרום הפלזמה של תאים, היא עדיין שומרת הומולוגיה ברצף משמעותית עם מובילי ABC אחרים. מעניין לגלות שהחלקים מיוחדים של CFTR (כלומר אזור הרגולציה שלה ו-N-ו-C-Termini) חולקים שום דמיון רצף משמעותי עם מובילי ABC מטזואניים אחרים, ומכאן שאין רמזים לגבי המקורות דואר של רצפים אלה בCFTR. על בסיס המבנה הראשוני שלה, CFTR מסווג חבר של משפחת טרנספורטר ABC C-משפחה, אבל אין ראיות חזקות להצמדה פונקציונלית שיורית למשנה המשפחה הזאת. היו כמה דיווחים על פעילות תחבורת גלוטתיון לCFTR 5-7, וזה יהיה בקנה אחד עם התפקידים של חברי C-משפחה אחרות 8,9, אם כי דיווחים אחרים עולה כי גלוטתיון מופחת עשוי לעכב את פעילות CFTR ATPase, ולא מראה את גירוי-Induced מצע המאפיינים את מובילי ABC 10. מדידת מוליכות יון היא רגישה מספיק כדי לאפשר את פעילות הערוץ של מולקולות CFTR אחת כדי להיחקר 1 ומאפייני ערוץ CFTR כבר במעקב כפונקציה של זמן, טמפרטורה, ריכוז ה-ATP, פוטנציאל הממברנה, ומדינת זירחון, כמו גם ב נוכחותו של מארח של מעכבי מולקולה קטנים, potentiators, ומכפילים. אלהגם מחקרים שהוספנו באופן משמעותי לידע של איך מובילי ABC לתפקד שלנו. עם זאת, ביטוי של CFTR בסכומים משמעותיים והטיהור הבאה שלה הוכיח להיות מאתגר במיוחד וההצלחה הייתה מוגבלת לכמה מעבדות 10-13.
הצורך לפתח תרופות יעילות יותר דוחק, אך תהליך זה התעכב בשל חוסר CFTR מטוהר לסינון מולקולות קטנות. פתרון בעיית ביטוי CFTR והטיהור יאפשר הקרנת סמים תפוקה גבוהה שמטרתה לתקן את הפגם העיקרי בCF וגם לפתוח את מסלול ללימודים מבניים ברזולוציה גבוהה כדי ליידע את עיצוב סמים רציונלית. יתר על כן, אפילו מאפיינים ביוכימיים בסיסיים יחסית של חלבון, כגון מדינת oligomeric הפונקציונלית שלה, חלבוני אינטראקציה ופעילות ATPase יישארו מאופיינים בצורה גרועה. יש לנו דיווח פרוטוקול לביטוי בקנה מידה גדולה של ה-GFP-CFTR והעכברי מתויג-בעברבס 14 cerevisiae ועכשיו יתאר נוסף פרוטוקולים לטיהור של CFTR. יש לנו להשתמש בשיטות אלה כדי לטהר את חמש orthologues של CFTR, ומציג נתונים לטיהור של CFTR עוף לדוגמא ירושלים. הבחירה של חומרי ניקוי לsolubilization וטיהור היא שלב קריטי בטיהור של כל חלבון בממברנה. לאחר שהוקרן למסיסות של CFTR בכמה חומרי ניקוי, בחרנו שני חומרי ניקוי מנוגדים לשימוש בטיהור. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) הוא חומר ניקוי nonionic שכבר נעשה שימוש נרחב לשני מחקרים מבניים ותפקודיים של חלבונים בממברנה 15-21. חומר הניקוי היוני 1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1'-RAC-גליצרול) (גפ"מ-14) הוא יעיל ביותר בsolubilization של CFTR ועבר כבר נעשה שימוש בטיהור של חלבונים בממברנה פונקציונליים 10, 22,23, כולל טיהור של CFTR מס 24 cerevisiae. </ P>
שתארנו בעבר שיטה לביטוי היתר של CFTR העכברי 14. מאז פרסום כי הפרוטוקול, שהבענו וטהר כמה orthologs שונה של CFTR באמצעות אותה המערכת. כל orthologs נבדק עד כה מטוהר היטב בחומר ניקוי גפ"מ, תוך טיהור DDM הראתה יותר וריאציה על פני orthologs שונה (מידע לא מוצג). גמישות זו ממחישה את עוצמתו של שמרי הגישה: זה אפשרי למסך מבנים רבים במהירות היחסית כדי לבחור באחת למטרה מסוימת.
שטיפת השמרים microsomes עם מאגר המכיל 1 M NaCl לפני solubilization עם תוצאות DDM בהכנת גופיפון נקיה יותר ומפחית את המזהמים בשלבים מאוחר יותר. שלב זה הוא מיותר בפרוטוקול גפ"מ כמדגם CFTR הסופי הוא> 90% טהור בלי לשטוף גופיפון. יתר על כן, טיהור בDDM דורשת מספר שינויים במאגרים לsolubilizationטיהור nd, כלומר התוספת של גליצרול ומלח נוספים. יחד, תוספות אלה הגדילו באופן משמעותי מחייבות של חלבון DDM-solubilized לעמודה.
יש מתודולוגיה טיהור DDM היקף לשיפור, בפרט הסרת מזהמים עיקריים 40 kDa ש, נשפטו על ידי ספקטרומטריית מסה, בשל מקטע השמרים ריבוזומלי L3, אשר נראה כי יש זיקה מהותית לשרף ניקל. אין רצף polyHis ברור בחלבון L3, אך בחינה של מבנה 3D שלה כאשר חייב הריבוזום (PDB = 1FFK) מראה כי יש לו את מקטע L3 המקופל אשכול polyHis פוטנציאלי. שהלהקה הזו היא פחות בעייתית בחומר מטוהר גפ"מ יכול להיות בגלל חומרי ניקוי גפ"מ יותר קשה.
למרות הטיהור בDDM נראית עני יותר מזה בגפ"מ, חומרי ניקוי מתונים יותר כגון DDM עשוי להיות תואמים יותר עם ניתוחים תפקודיים ומבניים וכבר השתמשו בכמה crystall רנטגןמחקרי ographic של חלבונים בממברנה 15-21. יתר על כן, התוצאות שלנו מצביעות על כך שהשימוש בגפ"מ מוביל לאובדן של תפקוד ATPase בביחס CFTR לטיהור בDDM. מכאן אנו ממליצים על פרוטוקול הטיהור מבוסס גפ"מ עבור הדור של CFTR בי טוהר הוא קריטי, למשל ביישומים כגון אפיון לאחר translational שינויים, או בדור של נוגדנים, הפרוטוקול מבוסס גפ"מ ייבחר . מצד השני ביישומים שבם הפעילות והמצב טבעי לחלוטין של החלבון חיוני, היינו מציע מבוסס פרוטוקול DDM כאפשרות טובה יותר.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור לבידוד של CFTR בDDM גפ"מ-14 או חומר הניקוי שאינו היוני חומר ניקוי zwitterionic. ככזו, היא מצביעה על טווח רחב יותר של תנאים לטיהור CFTR מאשר דווחו בעבר 10-13. במיליגרם בנוסף כמויות של CFTR מטוהר יכולות להיותשהושג באמצעות נהלים אלה בשילוב עם מערכת שמרי צמיחה בנפח גבוה, כגון מערכת קצירת תא קיבולת גבוהה כמו הרוטור צנטריפוגה במהירות נמוכה 6 L פרמנטור ו20 L. יש CFTR השיג תג ה-GFP cleavable המאפשר ניטור קל של החלבון במבחני ביוכימיים וbiophysical שונים.
ניתן להשיג מגיב שתואר בכתב היד הזה (פלסמיד המכיל CFTR עוף או תאי שמרים קפוא) באמצעות קרן סיסטיק פיברוזיס (ארה"ב).
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי הקרן האמריקנית סיסטיק פיברוזיס (CFF) באמצעות קונסורציום מבנה CFTR 3D שלה. TR מומן על ידי מלגת לימודים בבריטניה CF אמון, וצפון קרוליינה על ידי מלגת לימודים בבריטניה BBSRC. אנו מכירים עמיתינו בקונסורציום מבנה CFF CFTR 3D לעזרת והעצה ועל העיצוב של תגי רצף CFTR עוף וטיהור מותאמים קודון.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |