우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
세포와 조직에 기계적인 힘의 응용 프로그램이나 그 수있는 도구는 생물학적 조직의 기계적 특성이 기본 mechanobiology의 이해에 크게 기여 정량화 할 수 있습니다. 이 기술은 광범위하게 각종 질병의 발병과 진행이 크게 기계적 신호에 의해 영향을하는 방법을 설명하는 데 사용되었다. 이 문서는 기계적으로 하나의 세포를 자극하거나 조직의 기계적 강도를 정량화 할 수 있습니다 다기능 축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 독립적으로 제어 할 수있는 네 개의 보이스 코일 모터로 구성되어 있습니다. 단일 세포는 하나, 복잡한 동적 및 공간적 변화 스트레인 필드에 세포를 노출 할 수 있도록 모터에 부착 될 수있는 유연한 기판상에서 배양 될 수있다. 반대로, 로드셀을 통합하여, 하나는 이들이 변형 사이클에 노출 될 때 기본 조직의 기계적 특성을 정량화 할 수있다.두 경우 모두, 클램프의 적절한 세트를 설계해야하고 단단히 유연성 기판 또는 그 조직을 유지하기 위하여 BAXS 플랫폼 모터에 장착. BAXS 플랫폼은 연신 실험 동안 샘플의 구조적 또는 생화학 적 반응을 조사하기 위해 동시 투과광 및 / 또는 형광 이미징을 수행하는 도립 현미경에 장착 될 수있다. 이 문서에서는 BAXS 플랫폼의 디자인과 사용의 실험 세부 사항을 제공하고 단일 셀 및 전체 조직 연구에 대한 결과를 제시한다. BAXS 플랫폼은 기판 변형시키고 절연 쥐 대동맥의 강성을 측정하는 것에 응답하여 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 변형을 측정 하였다. BAXS 플랫폼은 하위 세포, 세포 및 전체 조직 수준에서 신규 mechanobiological 통찰력을 제공하기 위해 다양한 광학 microscopies과 결합 될 수있는 다양한 도구이다.
서론
기계적인 미세 환경은 조직의 발달 및 항상성에 또한 질병 1-6에 지대한 영향을 미칠 예컨대 증식, 이동 및 분화와 같은 다양한 세포 기능에 중요한 역할을한다. 수년에 걸쳐, 실험의 여러 도구는 기계적으로 세포 나 조직을 자극하고 기본 mechanobiology에 대한 우리의 이해를 증가시키고 질병 6-17의 발병과 진행을 공부하는 것을 목표로 생물 조직의 기계적 특성을 측정하는 데 사용되었다. 그러나, 하나는 종종 특정 연구의 목적을 달성하기 위하여 여러 가지 실험 장치에 의존한다. 이 문서에서는 기계적 특성 및 기계적 힘이 전체 조직 저울의 길이에 하위 세포 생물학에서 재생하는 역할을 조사 연구를 허용하는 단일, 멀티 기능, 이축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 quantificatio 수 있습니다뿐만 아니라,또한 기계적 격리 조직의 특성 만의 N은 생체 내에서 발생하는 연신 그들의 응답을 이해하기 위해 살아있는 세포로, 간단한 복소 및 동적 스트레인 필드를 적용하는 능력을 용이하게한다. BAXS 플랫폼은 세포와 조직에 기계적인 테스트와 동요 동안 라이브 세포 현미경을 수행 할 수있는 능력을 유지합니다.
BAXS 플랫폼은 세포 수준에서, 기판 변형의 효과를....
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프로토콜
단일 세포의 1. 기계 변형
- 임베디드 형광 구슬을 가진 PDMS 기판의 제조
이전에 기판의 제조에, 물 해결책에있는 형광 마이크로 스피어의 소수성으로 인해 PDMS에 구슬 혼합을 향상시키기 위해 이소프로판올에 재현 탁하고 있습니다.- 10 분 동안 16,200 XG에 1.5 ML의 microcentrifuge 관과 원심 분리기에 형광 마이크로 피펫 500 μL.
- 뜨는을 취소하고 추가 이소프로판올 500 μL은 소용돌이로 교반의 5 분으로 하였다. 어떤 큰 입자가 침강 집계 있도록하기 위해 어둠 속에서 밤새 옆 유리 병을 넣어.
- 다음 날 아침, 조심스럽게 깨끗한 마이크로 원심 유리 병에 뜨는을 제거합니다. 이 비드 용액을 5 개 이상의 기판을 제조하는데 사용될 수있다. 주 : 구슬 솔루션은 다음 3 일 동안 침전 할 것입니다. 펠렛을 재현 탁 않도록주의하십시오.
- 제공된 경화제 0.5 g을 붓고과학적인 균형을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 원심 유리 병에 PDMS 키트. 연속적인 단계로, 각 추가 사이에 1 분 동안 소용돌이로 교반, (6 개 15 μL의 추가에) 비즈 90 μL의 총을 추가합니다. 옆으로 설정합니다.
- PDMS의 10g을 달아 형광 비드로 보충 경화제 0.5 ....
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결과
스트레칭 셀
BAXS 플랫폼은 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 기계적 응답 (C2C12) 25 %의 기판의 변형에 노출을 조사하기 위해 사용 하였다. 근원 세포 세포는 근육 조직에서 발견하고 지속적으로 생체 내에서 기계적 스트레칭 및 압축에 노출되어 있습니다. 세포핵의 형상이나 기계적 성질은 유전자 발현 및 전사 활성 (20, 21)의 조절에 또한 발달 결함과 같은 허친슨 - 길 포드의 조로증 증후군 (HGPS), 에머리 같은 다양한 질병에 중요한 역할을하는 것으로 보여 - Dreifuss 근육 퇴행 위축 (EDMD), 확장 성 심근증, 조기 노화 및 암 22 ~ 25. 따라서, 외부로부터의 기계적 미세 힘이 핵의 구조와 기능에 영향을 미치는지 이해하는 것은 극도의 관심이다. BAXS 플랫폼 마일 힘의 전송을 조사하는 데 사용되었다 주요 또는 보조 축에 평행 한 기판을 스트.......
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토론
여기에 제시된 BAXS 플랫폼은 단일 세포의 조사에서 전체 조직에, mechanobiology의 연구에서 많은 실험을 용이하게한다. 또한, 플랫폼은 다수의 기계적인 자극 실험 및 다축 인장 시험을 허용하고 매우 유연한 구성이다. 이 플랫폼은 또한 생리 학적 조건에서 세포와 조직의 유지를 가능하게하고 스트레칭 실험시 현미경을 동시에 할 수 있습니다. 설치 클램프의 적절한 세트를 사용할 때 이전 섹션에서 설명 된 두 개의 실험 BAXS 플랫폼의 다양성을 설명한다. 모듈 제작 샘플 장착 시스템, 광 액세스 및 추가 센서 (예를 들어로드 셀)를 추가 할 가능성이 수행 될 실험 밖의 유형의 다양한 가능성을 열어.
위에서 밝힌 프로토콜을 수행해야합니다 많은 중요한 단계를 포함하는dequately 최상의 결과를 생산하기 위해. 세포 스트레칭 프로토콜 내에서 클램프에 PDMS 기판을 장착하여 섬세하고 정확한 조작을 요구한다. PDMS 기판 .......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
DT는 르 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡 - 자연 등 기술 (FQRNT)와 MITACS 높이기 전략 원정대에서 박사 재학에 의해 지원되었다. CMC는 르 퐁 드 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 (FRSQ)와 어니스트 오타와 심장 연구소의 대학에서 마가렛 포드 심장 부여 연구 활동에서 박사 재학에 의해 지원되었다. EOB는 운영 보조금 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에서 MOP80204과 마음에서 T6335과 온타리오의 뇌졸중 재단에 의해 지원되었다. CIHR과 메드 트로닉은 집단적으로 피어 리뷰 연구 의자 (URC # 57093)와 EOB를 제공합니다. AEP는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 NSERC 발견 가속기 보충에 의해 투자하고 감사 한 캐나다 연구 의자 (CRC) 프로그램 및 온타리오 주에서 조기 연구원 상의 지원을 인정한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | 이 프로토콜에 사용된 베이스와 가교제의 비율은 20:1입니다. 먼지가 당신을 오염시키는 것을 막기 위해 층류 후드를 섞으십시오. |
| FluoSpheres 형광 마이크로스피어 | Invitrogen | F8810 | 빛을 멀리하십시오. |
| 리니어 보이스 코일 | Moticont | LVCM-051-051-01 | motro는 두 조각(자석과 코일)으로 제공됩니다. 작동하려면 볼 베어링 시스템에 장착해야 합니다. |
| 볼 베어링 슬라이드 | Edmund Optics | NT37-360 | 미니어처 및 소형 선형 모션 볼 베어링 슬라이드 |
| 선형 포지셔닝 스테이지 | Edmund Optics | 38-960 | 센터 드라이브 1.25" 스퀘어 선형 변환 스테이지 |
| 광학 인코더 | GSI microE 시스템 | Mercury II 1600S - 0.5um 해상도 | 반사 증분 인코더. |
| 모션 컨트롤러 | Galil | DMC-2143 (DIN) -DC48 AMP-20440 | 4 축 증폭기가있는 4 축 컨트롤러 |
| 로드셀 | Honeywell | 31 | 0-150g 범위의 저소형 로드셀 |
| 곤충 minutiens 핀 (0.20 mm) | 핀 서비스 Austerlitz 곤충 핀 | 열린 삼각형 모양으로 구부러진 스테인레스 스틸 핀 | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | 영구 에폭시 네거티브 포토레지스트. 열과 빛으로부터 멀리하십시오 |
| 공기 플라즈마 치료 시스템 | Glowresearch | Autoglow 산소 플라즈마 시스템 | |
| 쥐꼬리 콜라겐 | Invitrogen | A10483-01 | 콜라겐 I, 쥐 꼬리 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA 특이적 형광 염료. 냉장고에 보관하십시오. |
| 캡톤(폴리이미드 필름) 절연 플렉시블 히터 | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28V 플렉시블 히터, 24V |
| 1/16 DIN 자동 조정 온도 및 프로세스 컨트롤러 | omega.ca | CN63200-R1-LV | 온도 컨트롤러와 함께 제공 가능, 24V 공급. |
| DMEM 배양 배지 | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco' s 수정 된 30 독수리 매체. 4 °으로 유지; C |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 하이클론 | SV30010 | 재고를 냉동 상태로 유지하십시오. 4 °C에서 솔루션을 계속 작동시킵니다. |
| 소 태아 세럼 (FBS) | Hyclone | SH3039603C | 냉동 보관. |
| 트립신 0.05% | 하이클론 | SH30236.02 | 냉동 보관. subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES 완충 염 용액을 |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES 완충 염 용액 / Krebs 생리학적 용액 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액 |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액 |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액 |
| 덱스트로 | 오스 Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES 완충 염 용액 / 크렙스 생리학적 용액 |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | 크렙스 생리학적 용액 |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs 생리학적 용액 Carbogen |
| 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs 생리학적 용액 산소화 |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | 미세소관 탈중합제 |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin 필라멘트 탈중합제 |
| Anti-α- SMA-FITC | Sigma | F3777 | 평활근 세포 함량을 염색하고 정량화하는 데 사용 |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | 콜라겐 함량을 염색하고 정량화하는 데 사용됩니다 |
참고문헌
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N.....
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재인쇄 및 허가
