ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.
Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.
Bakterier har utviklet seg til å svare på mange stressende forhold. Et generelt trekk ved tilpasning til stress er en endring i vekstdynamikk 1,2. Vekst dynamikk kjennetegnes hovedsakelig av to parametre: den eksponentielle veksten rente og lag tid, nemlig tiden det tar å tilpasse seg nye forhold. Mens et stort antall av høy gjennomstrømning metoder fokuserer på målinger av veksthastigheten, er lag tid ofte en oversett parameter, selv om det er den avgjørende parameter for karakterisering av tilpasningen til nye betingelser. Kvantifisering av tilpasning til endrede forhold har tradisjonelt blitt utført ved hjelp av arbeidskrevende manuelle metoder 3,4. Mer nylig har avanserte teknikker blitt utviklet for analyse av enkeltceller 5,6. Imidlertid er det fremdeles vanskelig å skille normal vekst etter en forsinkelse i vekst (dvs. en oppholdstid) 2,3 fra langsom vekst. En automatisert metode ble bygget, ScanLag 7, tilskjelne mellom disse to lignende fenotyper.
Et slående eksempel på viktigheten av studiet av lag tid fordelingen er avslørt etter antibiotikabehandling. Mange antibiotika og andre påkjenninger drepe bare aktivt voksende celler, og derfor celler som er "lagging" er beskyttet 8.. For å overvåke lag tid, kan man observere enkeltceller under et mikroskop og overvåke tiden til første divisjon. En stor ulempe med denne metoden er at den dynamiske tidsområde er begrenset; de celler som vokser tidlig dekke overflaten på en eksponentiell hastighet, effektivt redusere veksten av celler med lengre oppholdstid. Bruk av strømningskamrene noe omgår denne 5, men et begrenset antall celler kan bli sporet og den del av bakterier som kommer ut fra følgefase etter at størstedelen av befolkningen har begynt å vokse, kan ikke observeres. Til tross for disse begrensninger har flere studier evaluert påvirkning av nivået av different streker på lag tid distribusjon med enkelt celle mikros 9-12. En annen måte å overvåke oppholdstid fordelingen er ved turbiditetsmålinger 13,14. Mange parallelle kulturer, hver gang fra en enkelt celle, ble dyrket i en optisk densitet leser som måler antallet bakterier i kultur over tid. Denne metoden er begrenset av nøyaktigheten av den ekstrapolering og til antallet brønner i en plate.
En automatisert metoden ble utviklet, kalt ScanLag, som gjør det mulig for lag ganger og vekst tids distribusjoner som skal vurderes, selv for den lille prosentandelen av bakterier i en befolkning som har svært lange etterslep ganger. Fremgangsmåten er basert på deteksjon av kolonier på konvensjonelle nærings agarplater 15 (figur 1). For å automatisere deteksjon 16,17 en rekke kommersielle skannere 18 som er rettet av i huset programvaren regelmessig hente bilder av platene, ble konstruert. Programvare varutformet for automatisk å analysere bildene og ekstraher kvantitative parametre 19,20, slik som tidspunktet for opptreden av hver koloni og veksttiden for hver koloni, som er definert her som den tid til å vokse fra 20 piksler til 80 piksler. Her presenterer vi metoden i detalj, inkludert oppsett av systemet, og bruken av det automatiserte bildeanalyse-programvare som er blitt forbedret med en bedre brukergrensesnittet.
Denne metoden kan være tilpasset for å måle andre egenskaper av kolonier, som morfologi og farge. Måling av disse typer parametere vil tillate systemets bruk i flerdimensjonale phenomics. Ettersom metoden detekterer kolonier fra enkeltceller, kan systemet avsløre nye fenotyper som ikke lar seg måle ved populasjonsnivå-målinger. Teknikken gjør det mulig å oppdage og gjenfinning av sjeldne varianter, og legger til rette for screening for ønskede egenskaper.
Mikroskopiske metoder basert på direkte observasjon er ofte sett på som den "gylne standard" for å studere encellede atferd. ScanLag, som muliggjør måling av fordelingen av lag ganger i bakteriepopulasjoner, gir data i god overensstemmelse med den fordeling oppnådd fra enkeltcelleanalyse og oppnår mye høyere statistikk.
Flere kritiske trinn må utføres for at denne metoden skal fungere godt: første, ikke kompromisser på skanneroppløsning, noe som bør være 4800 x 9600 for å få gode bilder. For det andre, være klar over at uten strømstyring modulen (trinn 1,6), kan temperaturgradient utvikle seg på plans overflaten og påvirker vekst. Et annet viktig skritt er filtrering av defekter som støv som kan ha blitt feilaktig regnes som kolonier av programvaren. Den innebygde bakgrunns subtraksjon av programvaren overvinner vanligvis disse feilene, men noen ganger "falske" kolonier måmanuelt filtrert.
De viktigste feilsøkingstrinn kan løse inter-plate variasjon i oppsettet, på grunn av flere grunner: (a) Veksttakten av mikroorganismer blir påvirket av temperatur. Forskjellige temperatur-og fuktighetsforhold kan oppstå på grunn av ujevn ventilasjon eller plassering av fatet i inkubatoren. (B) Elektronikken i skanneren kan varmes opp og forårsake en temperatur-gradient tvers over overflaten av skanneren. Figur 10 viser påvirkningen av en slik romlig varme gradient på Bacillus bakterier, sammen med målinger av temperaturen på skanneoverflaten før og etter å implementere strømstyring modulen (trinn 1,6). Legg merke til at denne modul ikke er nødvendige for at nyere skannere, og hvis bare en del av skannerens overflate blir brukt, kan strømstyring være unødvendig. (C) Plater med forskjellig tetthet av agar næringsstoff kan føre til ulike nivåer av gjenkjenning. Figur 11 viser the toleranse for forskjellige volumer av næringsagar som resulterer i forskjellige uklarheter.
Eksperimentelt den ScanLag teknikk er enkel å utføre og krever kun til platen mikroorganismer på standard petriskåler, og å plassere dem på overflaten skanneren. Programvaren som ble utviklet kontrollerer hele prosedyren. Bildet Kjøpet er gjort automatisk, og bildeanalyse for koloni sporing er også automatisk. Videre kan systemet bli skalert opp for å måle mange forskjellige forhold på samme tid. Til slutt, avhengig av metoden på kommersielle kontor skannere og derfor er billig.
Denne teknikken kan utvides til studiet av mikroorganismer som er forskjellige fra E. coli K-12, men en rekke betraktninger må gjøres. For det første har de innflytelse på tidlige vises kolonier på de senere meldinger som skal vurderes, som beskrevet i detalj i en tidligere publikasjon 7.. For E. Coli K-12, ermaksimal tetthet av CFU per plate er 200. Andre stammer med forskjellige størrelser av kolonier, og andre mulige krysstale mellom koloniene, kan kreve en annen tetthet. For det andre, er analysen av platene kalibrert til spesifikke programvarebasert terskler som kan trenge å bli endret, avhengig av kontrasten mellom det faste mediet og de kolonier. Programvaren kan utvides også til å trekke andre koloni kjennetegn, utover etterslep og vekst. Programvarekoden er åpen og kan bli endret for å trekke koloni form, lysstyrke, glatthet og farge.
Fordi målingene er gjort på kolonier som stammer fra enkeltceller, Dataene avdekker nye fenotyper som ikke kan måles med befolkningsnivå målinger. Betydningen av forsinkelsen fordelingen er åpenbart i nærvær av antibiotika. Mange antibiotika er kjent for å være effektivt bare mot voksende celler; derfor, så lenge cellene forbli i lag fasen og ikke vokse, er de probeskyttes fra virkningene av disse antibiotika 21. Når antallet overlevende bakterier blir evaluert ved tidsintervaller under antibiotikabehandling 15,22,23, er en subpopulasjon av bakterier, kalt persisters, ofte avdekket. I visse tilfeller, immunitet mot antibiotikabehandling stammer fra langvarig lag. Ved hjelp av dette oppsettet, er dette etterslepet avslørt og ofte har en ikke-triviell distribusjon 24 (figur 6). Denne metoden gjør det også henting av sjeldne mutanter. For eksempel, etter å ha belagt en mutageniserte populasjon, mutanter kan bli identifisert basert på fenotype og isolert direkte, uten markering. Installasjonen kan også overvåke celle-celle interaksjoner ved å måle veksten av kolonier som en funksjon av tettheten av nærliggende kolonier og for å kvantifisere fenomener som bakteriekommunikasjon eller spredning av svermende bakterier. Flerdimensjonal informasjon avdekket av fremtidige eksperimenter ved hjelp av denne metoden vil føre til bedre karakterisering av tarmfloraens og til fremskritt innen medisinsk og miljøforskning.
The authors have nothing to disclose.
We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Difco LB broth | BD | 240230 | |
Petri dish 90mm | Miniplast | 20090-01 | |
Name of Equipment | |||
Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution: 4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit. |
Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
pieces of sterile black felt cloth | custon made | approximatly 100 x100 mm | |
white plate holders | custon made | surface size, with 6 x 99mm diameter hole | |
Delerin rings the size of the Petri dish | custon made | inner diameter: 72 mm outer diameter: 86 mm top outer diameter: 90 mm |