ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.
Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.
Bakterier har utvecklats för att bemöta många stressande förhållanden. Ett allmänt drag av anpassning till stress är en förändring i tillväxtdynamik 1,2. Tillväxtdynamiken kännetecknas främst av två parametrar: den exponentiella tillväxttakten och den eftersläpning tid, det vill säga den tid som behövs för att anpassa sig till nya förhållanden. Ett stort antal av hög genomströmning metoder fokuserar på mätningar av tillväxttakten, är den fördröjning ofta en förbisedd parameter, även om det är den avgörande parametern för karakterisering av anpassning till nya förhållanden. Kvantifiering av anpassning till förändrade förutsättningar har traditionellt utförts med hjälp av arbetskrävande manuella metoder 3,4. På senare tid har avancerade tekniker utvecklats för analys av enskilda celler 5,6. Det är dock fortfarande svårt att skilja normal tillväxt efter en försening i tillväxt (det vill säga en fördröjning) 2,3 från långsam tillväxt. Ett automatiserat förfarande konstruerades, ScanLag 7, tilldiskriminera mellan dessa två liknande fenotyper.
Ett slående exempel på hur viktigt det är att studera den fördröjning fördelningen avslöjas i antibiotikabehandling. Många antibiotika och andra påkänningar döda bara aktivt växande celler, och därför celler som "släpar" är skyddade 8. För att övervaka fördröjning kan man observera enskilda celler under ett mikroskop och övervaka tiden till första divisionen. En stor nackdel med denna metod är att den dynamiska tidsområde är begränsat; de celler som växer tidigt täcka ytan med en exponentiell hastighet, vilket effektivt minskar tillväxten av celler med längre fördröjning. Användning av flödeskammare kringgår något i 5, men ett begränsat antal celler kan spåras och kan inte observeras den fraktion av bakterier som kommer ut ur fördröjningsfasen efter att majoriteten av befolkningen har börjat växa. Trots dessa begränsningar har flera studier utvärderades påverkan av nivån av different betonar på fördröjning distribution via en enda cell mikroskopi 9-12. Ett annat sätt att övervaka fördröjning fördelning är genom grumlighetsmätningar 13,14. Många parallella kulturer, vardera startade från en enda cell, odlas i en optisk densitet läsare som mäter antalet bakterier i kultur över tiden. Denna metod är begränsad av noggrannheten hos den extrapolering och med antalet brunnar i en platta.
En automatiserad metod utvecklades, kallades ScanLag, som gör att fördröjningstider och tillväxt tidsfördelningar som ska bedömas, även för den lilla andel av bakterier i en befolkning som har mycket långa fördröjningstider. Metoden är baserad på detektering av kolonier på konventionella näringsagarplattor 15 (figur 1). För att automatisera upptäckt 16,17 en rad kommersiella skannrar 18 som är regisserad av i huset programvara för att regelbundet få bilder av plattorna, var konstruerad. Programvaran varutformat för att automatiskt analysera bilderna och extrahera kvantitativa parametrar 19,20, till exempel tidpunkten för uppkomsten av varje koloni och tillväxttiden för varje koloni, som definieras här som den tid att växa från 20 pixlar till 80 pixlar. Här presenterar vi den metod som i detalj, inklusive konfigurationen av systemet och användningen av automatiserad bildanalysmjukvara som har förbättrats med ett bättre användargränssnitt.
Denna metod kan anpassas för att mäta andra egenskaper hos kolonierna, såsom morfologi och färg. Mätning av dessa typer av parametrar gör det möjligt för systemets användning i flerdimensionella Phenomics. Eftersom metoden detekterar kolonier från enstaka celler, kan systemet avslöja nya fenotyper som inte kan mätas genom mätningar befolkningsnivå. Tekniken gör det möjligt att upptäcka och hämtning av sällsynta varianter, och underlättar screening för önskade egenskaper.
Mikroskopiska metoder baserade på direkt observation betraktas ofta som den "gyllene standarden" för att studera encelliga beteende. ScanLag, vilket möjliggör mätning av fördelningen av fördröjningstider i bakteriepopulationer, tillhandahåller data i god överensstämmelse med fördelningen som erhålls från singel-cellanalys och uppnår mycket högre statistik.
Flera viktiga steg måste utföras för att denna metod ska fungera väl: först, inte äventyrar på skannerupplösning, som bör vara 4,800 x 9,600 för att få bra bilder. För det andra, vara medveten om att utan effekthanteringsmodulen (steg 1,6), kan temperaturgradient utvecklas på flatbädden ytan och påverka tillväxten. Ett annat viktigt steg är filtreringen av defekter såsom damm som kan ha blivit felaktigt räknas som kolonier av programvaran. Den inbyggda bakgrundssubtraktion av programvaran övervinner oftast dessa brister, men ibland "falska" kolonier måstemanuellt filtrerades.
De viktigaste åtgärder för felsökning kan ta itu med mellanplatta variation i installationen, på grund av flera orsaker: (a) Tillväxttakten av mikroorganismer påverkas av temperaturen. Olika temperatur-och fuktighetsförhållanden kan uppstå på grund av ojämn ventilation eller lokalisering av skålen i inkubatorn. (B) Elektroniken i skannern kan värma upp och orsaka en temperaturgradient över ytan av skannern. Figur 10 visar påverkan av en sådan rumslig värme lutning på Bacillus bakterier, tillsammans med mätningar av temperaturen på skannerytan före och efter att genomföra effekthanteringsmodulen (steg 1,6). Observera att denna modul inte kan vara nödvändigt för nyare skannrar, och om endast en del av skannerns yta användes kan strömhanterings vara onödig. (C) Plattor med olika opacitet agar näringsämnen kan leda till olika nivåer av upptäckt. Figur 11 visar the tolerans för olika volymer av näringsagar som resulterar i olika opacitet.
Experimentellt den ScanLag tekniken är enkel att utföra och kräver endast till tallrik mikroorganismer på standardpetriskålar, och att placera dem på skannerns yta. Den programvara som utvecklades kontrollerar hela proceduren. Bilden Förvärvet sker automatiskt, och bildanalys för koloni spårning är också automatiskt. Vidare kan systemet skalas upp för att mäta många olika förhållanden på samma gång. Slutligen har den metod på kommersiella kontorsskannrar, och därför är en låg kostnad.
Denna teknik kan utsträckas till studier av mikroorganismer, vilka skiljer sig från E. coli K-12, men flera överväganden måste göras. För det första har påverkan av tidiga före kolonier på de senare som skall bedömas, som beskrivs i detalj i en tidigare publikation 7. För E. Coli K-12, denmaximal täthet av CFU per platta är 200. Andra stammar med olika storlekar av kolonier, och andra möjliga överhörning mellan kolonier, kan kräva en annan densitet. För det andra är den analys av plattorna kalibrerad till specifika mjukvarubaserade tröskelvärden som kan behöva modifieras beroende på kontrasten mellan det fasta mediet och kolonierna. Mjukvaran kan även utvidgas att utvinna andra koloni egenskaper, bortom eftersläpning och tillväxt. Programvaran kod är öppen och kan ändras för att extrahera koloni form, ljusstyrka, jämnhet och färg.
Eftersom mätningarna görs på kolonier som kommer från enstaka celler, de data visar nya fenotyper som inte kan mätas genom mätningar befolkningsnivå. Betydelsen av den fördröjning fördelningen avslöjas i närvaro av antibiotika. Många antibiotika är kända för att vara effektiva endast mot växande celler; därför så länge som cellerna kvar i lagfas och växer inte, de är proffsskyddas från effekterna av dessa antibiotika 21. När antalet överlevande bakterier utvärderades vid tidsintervall under antibiotikabehandling 15,22,23, är en subpopulation av bakterier, som kallas persisters ofta uppenbarats. I vissa fall, immunitet mot antibiotika kommer från långvarig fördröjning. Med hjälp av denna inställning är denna eftersläpning avslöjas och ofta har en icke-trivial fördelningen 24 (Figur 6). Denna metod gör det också möjligt att återfinna sällsynta mutanter. Till exempel, efter plätering en muterad population, mutanter kan identifieras baserat på fenotyp och isoleras direkt, utan val. Installationen kan också övervaka cell-cell-interaktioner genom att mäta tillväxten av kolonier som en funktion av densiteten i närheten kolonier och att kvantifiera fenomen såsom quorum sensing eller spridning av svärmande bakterier. Multidimensional information som avslöjats av framtida experiment med den här metoden kommer att leda till en bättre karakterisering av mikrobiell populations och att framsteg inom medicinsk-och miljöforskning.
The authors have nothing to disclose.
We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Difco LB broth | BD | 240230 | |
Petri dish 90mm | Miniplast | 20090-01 | |
Name of Equipment | |||
Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution: 4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit. |
Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
pieces of sterile black felt cloth | custon made | approximatly 100 x100 mm | |
white plate holders | custon made | surface size, with 6 x 99mm diameter hole | |
Delerin rings the size of the Petri dish | custon made | inner diameter: 72 mm outer diameter: 86 mm top outer diameter: 90 mm |