In vitro metode til at observere E-selectin-medierede interaktioner mellem Prostata cirkulerende tumorceller afledt fra patienter og humane endotelceller
Summary
Vores rapport beskriver en unik metode til at visualisere og analysere CTC / EF interaktioner i prostatakræft under fysiologiske flow.
Abstract
Metastase er en proces, hvor tumorceller kaste fra den primære tumor intravasate blod vaskulære og lymfesystemet, derved at få adgang til ekstravasere og danne en sekundær niche. Ekstravasation af tumorceller fra blodet vaskulære system kan undersøges ved hjælp af endotelceller (EC'er) og tumorceller opnået fra forskellige cellelinjer. Indledende undersøgelser blev udført ved hjælp af statiske forhold, men det er veldokumenteret, at ECS opfører sig anderledes under fysiologiske flow. Derfor er forskellige flow chamber samlinger i øjeblikket anvendes til at studere kræft celle interaktioner med EC'er. Aktuelle flowkammer forsamlinger tilbyder reproducerbare resultater ved hjælp af enten forskellige cellelinjer eller væske ved forskellige shear stress. Men for at observere og studere interaktioner med sjældne celler såsom cirkulerende tumorceller (CTCs), skal gøres til den konventionelle flowkammer samling visse ændringer. CTCser en sjælden cellepopulation blandt millioner af blodlegemer. Derfor er det vanskeligt at opnå en ren population af CTCs. Forurening af CTCs med forskellige typer af celler, der normalt findes i omløb er uundgåelig hjælp til stede berigelse eller udtynding teknikker. I denne rapport beskriver vi en unik metode til fluorescens label cirkulerende prostatacancerceller og studere deres samspil med ECS en selvstændig samlet flow kammer system. Denne teknik kan anvendes yderligere til at observere interaktionen mellem prostata CTCs og helst protein af interesse.
Introduction
Metastase er en kompleks flertrinsproces, der forbliver dårligt forstået. Den E-selectin/selectin ligand akse har vist sig at spille en vigtig rolle i tumormetastase ved at fremme primære adhæsive interaktioner mellem det vaskulære endotel celler og cancerceller 1,2. Endotel (E)-selectin er et transmembrant protein, der udtrykkes af aktiverede endotelceller, mens forskellige E-selectin ligand (r) udtrykkes af tumorceller 3. Talrige in vitro-fremgangsmåder med succes er blevet anvendt til at modellere E-selectin/selectin ligand interaktioner mellem tumorceller og endotelceller (EC'er) 1.. At studere disse interaktioner er forskellige flowkammer systemer, der anvendes til at simulere blod kar-systemet. Blandt strømningskammeret samlinger er parallel-plade-strømningskammeret (PPFC), sammenholdt med EC'er rutinemæssigt anvendes som en in vitro model, der simulerer in vivo shear stress. I dennemetode EC'er dyrkes på en 35 mm skål og efter opnåelse et monolag, er EC'er knyttet til PPFC og forskydningsspænding baserede eksperimenter udføres.
Men PPFC og andre nuværende systemer præsentere mange begrænsninger til at studere klæbende interaktioner mellem cirkulerende tumorceller (CTCs) afledt fra patienter og ECS, primært fordi CTCs er en sjælden population af celler, skur fra den primære tumor, der cirkulerer blandt millioner af blodceller (1 CTC per 10 9 celler i blodet) 4.. Derfor, i modsætning til ubegrænset udbud af dyrkede cellelinier, lavt CTC tæller føre til meget få og sjældne CTC / EF interaktioner, der kræver ordentlig flow kanal bredde at registrere interaktioner for afspilning analyse. Derudover, da patientens afledte CTCs er et urent befolkning, derfor en identifikation markør er forpligtet til at spore CTCs i specifikke. For at løse dette problem, har vi udviklet en ny metode til at identificere prostatacancer (PSA) CTCs ved at udnytte det faktum, at næsten alle disse CTCs ekspres prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) på deres celleoverflade 5,6. I denne rapport har vi brugt prostata cancer cellelinie, MDA PCa2b (MDA), at demonstrere potentialet nytte af vores nye system til at studere prostata CTC interaktioner med ECS sidst at forstå den mekanisme af metastaser.
Vores metode kan anvendes til forskellige shear baserede eksperimenter, der simulerer in vivo vaskulære system 7-9. Udover behandlingen PCa CTC / EF interaktioner, kunne strømmen kammer system nemt tilpasses til analyse af perifert blod mononukleære celler eller tumorceller interaktioner med EC'er. Den lette demontering og samling af flowet kammeret, en mikroobjektglas III (0,1) (herefter benævnt mikroobjektglas), giver mulighed for dyrkning EC'er under perfusion og stimulerende EC'er med forskellige cytokiner at inducere PRotein udtryk. Desuden dyrkes EC'er rekombinante proteiner, såsom E-og P-selectin kan overtrækkes på mikroobjektglasset og interaktioner med tumorceller kan observeres under laminare strømningsbetingelser 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af det lave antal CTCs blandt blodlegemer, er det vanskeligt at isolere CTCs som en ren population af celler. For at studere CTC / EF interaktioner, den sjældne og urene befolkning CTCs stiller to store udfordringer: a) identifikation af CTCs blandt blodlegemer; b) Observation af CTC / EF interaktioner.
For at overvinde den første begrænsning identificere prostata CTCs blandt blodlegemer, tog vi fordel af det faktum, at stort set alle prostata tumorce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Department of Defense-Prostata Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 fra National Cancer Institute, og Robert McCooey Urogenitale Oncology Research Fund. Vi vil gerne takke Dr. Annarita Lorenzo (Department of Pathology) for at levere VE-Cadherin antistoffer, og Dr. Marco Seandel (Department of Surgery) til at tilvejebringe HUVEC'er.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
