मरीजों और मानव endothelial कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्रोस्टेट परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के बीच ई selectin की मध्यस्थता मुलाकातों का निरीक्षण करने के लिए इन विट्रो विधि में
Summary
हमारी रिपोर्ट शारीरिक प्रवाह परिस्थितियों में प्रोस्टेट कैंसर में सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक अनूठा तरीका वर्णन करता है.
Abstract
मेटास्टेसिस ट्यूमर कोशिकाओं एक माध्यमिक आला बह निकलना और के लिए फार्म का उपयोग हो रहा है, जिससे प्राथमिक ट्यूमर intravasate रक्त नाड़ी और लसीका प्रणाली से शेड जिसमें एक प्रक्रिया है. रक्त नाड़ी तंत्र से ट्यूमर कोशिकाओं की परिस्त्राव विभिन्न सेल लाइनों से प्राप्त endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) और ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. प्रारंभिक अध्ययन स्थिर शर्तों का उपयोग किया गया है, लेकिन यह अच्छी तरह से ईसीएस शारीरिक प्रवाह शर्तों के तहत अलग ढंग से व्यवहार कि प्रलेखित किया गया है. इसलिए, विभिन्न प्रवाह चैम्बर विधानसभाओं वर्तमान में ईसीएस के साथ कैंसर सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. वर्तमान प्रवाह चैम्बर विधानसभाओं अलग कतरनी तनाव की स्थिति में विभिन्न सेल लाइनों या तरल पदार्थ का उपयोग प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करते हैं. हालांकि, निरीक्षण और इस तरह के ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) परिसंचारी के रूप में दुर्लभ कोशिकाओं के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए, कुछ परिवर्तन पारंपरिक प्रवाह चैम्बर विधानसभा के लिए किए जाने की आवश्यकता है. CTCsरक्त कोशिकाओं के लाखों लोगों के बीच एक दुर्लभ सेल आबादी हैं. नतीजतन, यह CTCs की एक शुद्ध आबादी को प्राप्त करना कठिन है. सामान्य रूप से प्रचलन में पाया कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के साथ CTCs की संदूषण मौजूद संवर्धन या कमी तकनीक का उपयोग अनिवार्य है. वर्तमान रिपोर्ट में, हम fluorescently लेबल परिसंचारी प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को एक अनोखी विधि का वर्णन है और एक आत्म इकट्ठे प्रवाह चैम्बर प्रणाली में ईसीएस के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन. इस तकनीक को आगे प्रोस्टेट CTCs और ब्याज की किसी भी प्रोटीन के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
मेटास्टेसिस खराब समझ बनी हुई है कि एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है. E-selectin/selectin ligand अक्ष संवहनी endothelium और कैंसर कोशिकाओं 1,2 के बीच प्राथमिक चिपकने वाला बातचीत को बढ़ावा देने के द्वारा ट्यूमर मेटास्टेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है. अलग ई selectin ligand (ओं) ट्यूमर कोशिकाओं 3 द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, जबकि endothelial (ई) selectin के सक्रिय endothelial कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एक transmembrane प्रोटीन है. कई में इन विट्रो दृष्टिकोण सफलतापूर्वक ट्यूमर कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के बीच E-selectin/selectin ligand बातचीत (ईसीएस) 1 मॉडल के लिए नियोजित किया गया है. इन संबंधों का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न प्रवाह चैम्बर सिस्टम रक्त नाड़ी तंत्र अनुकरण करने के लिए नियोजित किया जा रहा है. प्रवाह चैम्बर विधानसभाओं के अलावा, ईसीएस के साथ संयोजन के रूप में समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर (PPFC) नियमित विवो कतरनी तनाव की स्थिति में अनुकरण इन विट्रो मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है. इस मेंविधि, ईसीएस एक 35 मिमी पकवान पर हो रहे हैं और एक monolayer को प्राप्त करने के बाद, ईसीएस PPFC से जुड़े होते हैं और कतरनी तनाव आधारित प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं.
हालांकि, PPFC और अन्य मौजूदा सिस्टम रोगियों और ईसी से व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs), परिसंचारी के बीच चिपकने वाला बातचीत का अध्ययन करने के लिए कई सीमाएं उपस्थित मुख्य रूप से, CTCs रक्त कोशिकाओं के लाखों लोगों के बीच घूम, प्राथमिक ट्यूमर से शेड कोशिकाओं के एक दुर्लभ आबादी, क्योंकि (1 सीटीसी 9 रक्त कोशिकाओं 10 प्रति) 4. इसलिए, सभ्य सेल लाइनों की असीमित की आपूर्ति के विपरीत, कम सीटीसी मायने रखता प्लेबैक के विश्लेषण के लिए बातचीत रिकॉर्ड करने के लिए उचित प्रवाह चैनल चौड़ाई की आवश्यकता होती है, बहुत कुछ और दुर्लभ सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत करने के लिए नेतृत्व. रोगी व्युत्पन्न CTCs एक अशुद्ध जनसंख्या के बाद से ही, इसलिए एक पहचान मार्कर विशिष्ट में CTCs ट्रैक करने के लिए आवश्यक है. इस समस्या को हल करने के लिए, हम (पीसीए) सीटी प्रोस्टेट कैंसर की पहचान करने के लिए एक नई विधि विकसितसीएस लगभग सभी इन CTCs की उनके कोशिका की सतह 5,6 पर प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन झिल्ली (PSMA) व्यक्त तथ्य यह है कि का लाभ लेने के द्वारा. इस रिपोर्ट में, हम अंत में मेटास्टेसिस के तंत्र को समझने की, ईसीएस के साथ प्रोस्टेट सीटीसी बातचीत का अध्ययन करने के लिए हमारी नई प्रणाली की संभावित उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए, प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन, एमडीए PCa2b (एमडीए) का इस्तेमाल किया.
हमारी कार्यप्रणाली विवो नाड़ी तंत्र 7-9 में अनुकरण विभिन्न कतरनी आधारित प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है. पीसीए सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत की जांच के अलावा, वर्तमान प्रवाह चैम्बर प्रणाली को आसानी से परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं का विश्लेषण या ईसीएस के साथ ट्यूमर कोशिकाओं 'बातचीत के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. disassembling और प्रवाह कक्ष के reassembling में आसानी, एक microslide III (0.1) (इसके बाद microslide के रूप में कहा गया है), छिड़काव और जनसंपर्क के लिए प्रेरित करने के लिए विभिन्न साइटोकिन्स साथ ईसीएस उत्तेजक तहत संवर्धन ईसी की अनुमति देता हैअभिव्यक्ति otein. इसके अलावा, सुसंस्कृत ईसीएस, जैसे ई और पी selectin पुनः संयोजक प्रोटीन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ microslide और बातचीत पर लेपित किया जा सकता है लामिना का प्रवाह की स्थिति 10 के नीचे देखा जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
कारण रक्त कोशिकाओं के बीच CTCs की कम संख्या के कारण, यह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी के रूप में CTCs अलग करने के लिए मुश्किल है. सीटीसी / चुनाव आयोग बातचीत का अध्ययन करने के लिए, CTCs की दुर्लभ और अशुद्ध आबादी दो प्रम…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विभाग के डिफेंस, प्रोस्टेट कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (W81XWH-12-1-0124) से धन के द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, और रॉबर्ट McCooey Genitourinary कैंसर रिसर्च फंड से U54CA143876. हम HUVECs प्रदान करने के लिए VE-cadherin एंटीबॉडी उपलब्ध कराने के लिए डा. Annarita लोरेंजो (पैथोलॉजी विभाग) का शुक्रिया अदा करना, और डॉ. मार्को Seandel (सर्जरी विभाग) होगा.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
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