В пробирке методом наблюдать Е-селектин-опосредованных взаимодействий между простаты циркулирующих опухолевых клеток, взятых от пациентов и эндотелиальных клетках человека
Summary
Наш отчет описывает уникальный метод для визуализации и анализа взаимодействия КТК / EC в рака простаты в физиологических условиях потока.
Abstract
Метастазы это процесс, в котором опухолевые клетки пролить от первичной опухоли intravasate сосудистой крови и лимфатической системы, тем самым, получить доступ к вытекать из сосудов в ткань и образованием вторичного нишу. Экстравазации опухолевых клеток из кровеносной системы могут быть изучены с помощью эндотелиальных клеток (ECS) и опухолевых клеток, полученных из различных клеточных линий. Первоначальные исследования проводились с использованием статических условиях, но она была хорошо документирована, что ЭК-разному ведут себя в физиологических условиях потока. Таким образом, различные узлы проточной камеры в настоящее время используется для изучения раковых клеток взаимодействия с ЭК. Текущие сборки камеры поток предложить воспроизводимые результаты, используя как различные клеточные линии или жидкости на различных стрессовых условиях сдвига. Тем не менее, наблюдать и изучать взаимодействия с редких клеток, таких как циркулирующих опухолевых клеток (CTCs), определенные изменения должны быть внесены в обычной сборке проточной камеры. ЦОКявляются редким клеточной популяции среди миллионов клеток крови. Следовательно, трудно получить чистую популяцию ЦОК. Загрязнение ЦОК с различными типами клеток, обычно находящиеся в обращении неизбежно используя настоящий обогащение или методы истощения. В настоящем докладе мы описываем уникальный метод флуоресцентной метки циркулирующих раковых клеток простаты и изучать их взаимодействие с ЭК в самоорганизующихся системы камеры поток. Этот метод может быть применен в дальнейшем наблюдать взаимодействие между CTCs простаты и любого белка, представляющего интерес.
Introduction
Метастазы является сложным многоэтапным процессом, что еще малопонятным. E-selectin/selectin ось лиганд, как было показано, играют важную роль в метастазировании опухолей, способствуя первичных адгезивных взаимодействий между сосудистого эндотелия и раковых клеток 1,2. Эндотелия (Е)-селектина представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый активированными эндотелиальными клетками, в то время как другая Е-селектина лиганд (ы) выражаются опухолевых клеток 3. Подходы Многочисленные в пробирке были успешно использованы для моделирования E-selectin/selectin лиганд взаимодействия между опухолевыми клетками и эндотелиальных клеток (ECS) 1. Для изучения этих взаимодействий, в настоящее время используется различные системы проточной камеры для имитации сосудистую систему крови. Среди камерных собраниях потока, поток камера плоского (PPFC) в сочетании с ЭК обычно используется в качестве модели в пробирке, имитирующей в естественных условиях стресса сдвига. В этомСпособ, ЭК выращивают на 35-мм чашку и после достижения монослой, ЭК прикреплены к PPFC и эксперименты напряжение сдвига на основе выполняются.
Тем не менее, PPFC и другие современные системы представить много ограничений к изучению адгезионные взаимодействия между циркулирующих опухолевых клеток (CTCs), полученные от пациентов и ECS, в первую очередь, потому, что ЦОК являются редким популяция клеток, сарай от первичной опухоли, циркулирующих среди миллионов клеток крови (1 СТС на 10 9 клеток крови) 4. Таким образом, в отличие от неограниченным запасом культивируемых клеточных линий, низкие показатели CTC привести к очень мало и редкие взаимодействия КТК / ЕС, требующие надлежащего ширину канала поток для записи взаимодействий для анализа воспроизведения. Кроме того, поскольку пациент, полученные ЦОК являются нечистыми населения, поэтому идентификация маркер требуется отслеживать CTCs в конкретных. Чтобы решить эту проблему, мы разработали новый метод для выявления рака предстательной железы (РПЖ) КТCs, воспользовавшись тем, что практически все эти CTCs выразить простатического специфического антиген мембраны (PSMA) на их клеточной поверхности 5,6. В этом докладе мы использовали простаты линию раковых клеток, MDA PCa2b (MDA), чтобы продемонстрировать потенциальную полезность нашей новой системы для изучения простаты CTC взаимодействия с ЭК, в конце концов, чтобы понять механизм метастазирования.
Наша методология может применяться для различных экспериментов сдвига на основе моделирующих в системе естественных сосудистой 7-9. Кроме изучения взаимодействия РПЖ СТС / ЕС, нынешняя система Проточная камера может быть легко адаптирована для анализа мононуклеарных клеток периферической крови или взаимодействия опухолевых клеток с ЭК. Легкость разборки и сборка проточной камеры, предметное стекло III (0.1) (далее как предметное стекло), позволяет культивирования ECs под перфузии и стимулирования ECs с различными цитокинами, чтобы побудить пр.otein выражение. Кроме того, культурный этике, рекомбинантные белки, такие как E-и P-селектина могут быть покрыты на предметное стекло и взаимодействия с опухолевыми клетками можно наблюдать в условиях ламинарного потока 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за малого количества циркулирующих опухолевых клеток среди клеток крови, трудно изолировать CTCs в виде чистого популяции клеток. С целью изучения взаимодействия КТК / EC, редких и нечистое население ЦОК представляет две основные задачи: а) выявление CTCs среди клеток крови; б) Наблюдение…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование из Министерства обороны-простаты программы исследований рака (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 из Национального института рака, и McCooey мочеполовой исследовательского фонда Роберта онкологии. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Annarita Лоренцо (отделение патологии) за предоставление VE-кадгерина, и д-р Марко Seandel (кафедра хирургии) для обеспечения HUVECs.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
