에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

Summary

우리는 급성 폐 손상을 모델링하기 위해, 분무에 의해 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드에 도전하여 호중구 폐 염증을 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 폐 격리, 기관 삽관 및 기관지 세척액에 대한 기본적인 수술 기법도 설명되어 있습니다.

Abstract

급성 폐 손상 (ALI)는 제한된 치료 옵션과 높은 사망률과 폐포 호중구을 특징으로하는 심각한 질병이다. ALI의 실험 모델은 질병의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 향상의 열쇠입니다. 그람 양성 세균에서 파생 된 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)는 호중구기도의 염증과 쥐의 폐 실질을 유도한다. 이러한 LPS와 같은 화합물의 효율적인 폐 전달하지만, 달성하기가 어렵다. 여기에 설명 된 방법에서, 마우스의 폐 전달이 에어로졸 녹농균 LPS 챌린지에 의해 달성된다. 용존 LPS는 압축 공기에 연결되어 에어로졸 분무기로 하였다. 생쥐는 에어로졸이 중단 된 후 2 분 컨디셔닝 한 후, 10 분간 플렉시 유리 상자에 LPS 에어로졸의 연속 흐름 노출시켰다. 포르말린 관류 다음에 기관 삽관 이후 기관지 세척은, 다음 멸균 페이지의 특성을 허용하는 수행 하였다ulmonary 염증. 에어로졸 LPS는 기관지 폐포와 조직 학적 평가에 의해 검출 된 폐포 호중구을 특징으로하는 폐 염증을 생성합니다. 이 기술은 몇 가지 제품으로 작은 비용으로 설정하고, 최소한의 교육과 전문 지식을 필요로 할 수 있습니다. 노광 시스템은 따라서 통상적 폐 병변에 대한 이해를 향상시키기 위해 잠재적으로, 임의의 실험실에서 수행 될 수있다.

Introduction

리포 폴리 사카 라이드 (LPS)는 그람 음성 세균 ^(1)의 세포벽 성분이다. LPS에 도전 급성 폐 손상, 급성 염증 세포의 침윤 염증과 ^부종이 특징으로하는 증후군의 잘 문서화 된 모델입니다. 또한, 폐 호중구 또한 COPD 악화 ^4를 모델링하는데 사용되어 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) ^3, 및 인간에서 LPS 챌린지의 특징이다. 따라서, LPS 노출의 실험 모델은 임상 적으로 인간의 병리를 이해하기 위해 적절하고 가치있는 도구입니다.

여기에 설명 된 에어로졸 LPS의 폐 전달의 목적은 전신 개입 없이도 도통 및 호흡기도에 호중구 염증 반응을 생성하는 것이다. LPS 도전의 여러 기술 이전에 기술되었다. LPS의 정맥 내 주입 투여 가장 일반적으로 사용되는 경로이다. 이 기술에 쉽게 접근 할 수 있지만, t그는 차 손상은 폐에 호중구 마이그레이션 다음 폐 상피 세포의 보조 파괴, 내피이다. 인트라 정맥 투여는 동물 모델에서 임상 사진을 복잡하게 할 수 있습니다 전신 ^염증이를 유도한다. 전신 염증은 내 기관 관리와 관찰되지 대조적이다. 이 기술은, 그러나, 노동 집약적이며, 마취제뿐만 아니라 상당한 훈련 ^{5, 6을} 필요....

Protocol

동물 연구는 북부 스톡홀름 동물 복지 윤리위원회에 의해 승인되었다. 실험 절차는 스웨덴어 법을 준수 하였다.

1. LPS 에어로졸을 생성

1. P. 정제 0.5 g을 녹여 부드러운 교반과 함께 50 ml의 멸균 식염수에 aeruginosa의 LPS 및 용해를 확인합니다. 1 mg / ml의 최종 농도로, 9 ml의 멸균 식염수에 용해하여 LPS를 1 mL로 희석. -20 ° C에서 알루미늄 호일과 가게와 빛으로부터 보호합니다.
2. 실온에서 어두운 가용화 LPS를 사용하기 전에 해동하고 즉시 잘 혼합한다.
3. 환기 수준 II 생물 학적 후드에서 분무기에 붉은 입구를 삽입하고, 제조업체 (그림 1의 실험 장치를 제시 검토 방식)에 의해 제공되는 튜브를 통해 가압 실내 공기에 분무기를 연결합니다.
   주의 : 적절한 개인 보호 장비, 반 얼굴 조각 재사용 respirat 포함또는 미립자 필터, 고글, 장갑, 보호 의복 노광의 과정 동안 사용되어야한다.

Results

에어로졸 P.에 도전 aeruginosa의 LPS는 보통 초기와 후기 시점에서 모두 우위 호중구 특징으로기도 내강 및 치조 공간에서 표시된 염증 반응을 산출한다.

에어로졸 LPS는 폐 호중구을 유도

C57BL / 6by 및 BALB / C 마우스에게 에어로졸 화 된 P. 노출시켰다 aeruginosa의 LPS 또는 단독으로 차량과 호중구가 폐포 세척액에 열거 하였다. C57BL 차량 생성 에어로졸에 노출 / 6by 마우스의 BALF의 총 세포 수는 단지 일반적으로 약 20 만 세포 이하와 셀은 몇 림프구 (0.5-5 %)과, 95-100% 단핵 세포로 구성하고, 폐포 세척액에는 호중구 없다 (그림 2A-C). 마우스는 6 시간 후, 에어로졸 LPS 전시와 함께 일반적으로> 50 세포를 폐포 세척액에서 증가 된 총 세포 수에 도전했다.......

Discussion

에어로졸은 LPS 상피 점막하 호중구 특징으로기도의 염증 반응을 발생시키고, 전도성기도뿐만 아니라 폐포를 둘러싼 공간. 이것은 함께 혈장 누출, 급성 폐 손상의 병리 대표 나타내는 BALF에서 증가 된 총 단백질 함량으로한다. LPS는 무균 염증을 유도 같이, 반응은 적응성 면역 반응에 독립적이며, 세균 감염에 대한 관련성에 한계가있다. 기술은 그러나 적응 면역 반응을 제외하여 염증 기전을 해부하기 위해 사용될 수있다.

방법은 간단하고 쉽게 다른 과학적인 질문에 대답하기에 적합하지만, 분무기 및 튜브의 선택은 매우 중요하다. LPS 및 결과 호중구의 증착은 여기에 설명 된 것보다 다른 입구, 분무기 및 튜브 유효성을 확인해야합니다. 또한, 덜 일반적인 마우스 성LPS에 다른 응답을 표시 할 수 있습니다 비가, LPS의 최적 용량은 각 변형에 대한 결정되어야한다. 등 ^{(12, 13)에} 의해 관측 더욱이, 에어로졸 생성 LPS 염증은 호중구, LPS의 비내 전.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
정제 된 Pseudomonas aeruginosa< / em> LPS	시그마 - 알드리치		유해한. 정화를 권장합니다. 다른 박트리아에서 정제된 LPS를 사용할 수 있습니다.
PARI LC 스프린트 스타 분무기	PARI 호흡기 장비 Inc.	023G1250
TSI 질량 유량계 4040	TSI	4040	공급 업체의 대체 제품을 사용할 수 있습니다.
Saint-Gobain 15.9mm Tygon 튜브	Sigma-Aldrich	Z685704	추천 브랜드.
탈착식 뚜껑이 있는 플렉시글라스 상자	맞춤 제작	N/A	150 x 163 x 205mm(측면에 2mm 구멍).
3M 하프 페이스피스 재사용 가능한 호흡기	3M	7503	추천 브랜드.
3M 고급 미립자 필터(P100)	3M	2291	추천 브랜드.
가위	VWR	233-1104	선호하는 가위를 사용할 수 있습니다.
겸자	VWR	232-1313	선호하는 겸자를 사용할 수 있습니다.
Intramedic PE50 폴리에틸렌 튜브	BD	427411	추천 브랜드.
Ethicon 2-0 Perma-hand 실크 트레드	VWR	95056-992	추천 브랜드.
26 ½ 게이지 니들			대체 공급업체가 존재합니다.
1ml BD 슬립 팁 주사기, 비멸균	BD	301205	대체 공급업체가 있습니다.
60ml BD Luer-Lok 주사기, 비멸균, 폴리프로폴렌	BD	301035	대체 공급업체가 있습니다.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	대체 공급 업체가 있습니다.
티ü RK의 솔루션	Merck Millipore	109277
탁상용 원심분리기			대체 제조업체가 있습니다.
Cytospin 4 세포원심분리기	Thermo Scientific	A78300003	대체 원심분리기를 사용할 수 있습니다.
HEMA-3 스탯 팩	Fisher Scientific	23-123-869	대체 염색 키트가 있습니다.
포르말린 용액, 중성 완충, 10%	시그마-알드리치	HT501128	대체 공급업체가 있습니다.