En metode for generering av Lunge neutrofili Bruke aerosolized Lipopolysaccharide

Summary

Vi beskriver en fremgangsmåte for indusering av nøytrofil lungebetennelse ved utfordring for aerosoli lipopolysakkarid ved forstøvning, for å modellere akutt lungeskade. I tillegg er basis kirurgiske teknikker for isolering lunge, trakeal intubasjon og bronkoalveolar lavage også beskrevet.

Abstract

Akutt skade lunge (ALI) er en alvorlig sykdom som kjennetegnes ved alveolar neutrofili, med begrenset behandlingstilbud og høy dødelighet. Eksperimentelle modeller av ALI er nøkkelen i å forbedre vår forståelse av sykdom patogenesen. Lipopolysakkarid (LPS) avledet fra gram-positive bakterier induserer nøytrofil inflammasjon i luftveiene og lunge parenchyma av mus. Effektiv pulmonal levering av forbindelser slik som LPS er imidlertid vanskelig å oppnå. I tilnærmingen som beskrives her, er pulmonal levering i mus oppnås ved utfordring til aeroPseudoMonas aeruginosa LPS. LPS ble oppløst aerosoliseres ved hjelp av en forstøver som er koblet til trykkluft. Mus ble utsatt for en kontinuerlig strøm av LPS aerosol i en pleksiglassboks i 10 minutter, etterfulgt av 2 minutter kondisjonering etter at aerosolen ble avbrutt. Trakeal intubasjon og påfølgende bronkoalveolar lavage, fulgt av formalin perfusjon ble deretter utført, noe som gjør det mulig for karakterisering av den sterile pulmonary betennelse. Aerosoliseres LPS genererer en lungebetennelse preget av alveolar neutrofili, oppdaget i bronchoalveolar kylling og ved histologisk vurdering. Denne teknikken kan settes opp på en liten kostnad med noen apparater, og krever minimalt med opplæring og kompetanse. Eksponeringssystemet kan dermed gjennomføres rutinemessig på noe laboratorium, med potensial til å forbedre vår forståelse av lunge patologi.

Introduction

Lipopolysakkarid (LPS) er en celleveggkomponent av gramnegative bakterier ^1. Utfordring til LPS er en veldokumentert modell av akutt lungeskade, et syndrom karakterisert ved akutt nøytrofil inflammasjon og ødem ^2. I tillegg er lunge neutrofili også et kjennetegn på kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) ^3, og LPS utfordring hos mennesker har blitt brukt til å modellere KOLS eksaserbasjoner ^4. Dermed eksperimentelle modeller av LPS eksponering er klinisk relevante og verdifulle verktøy for å forstå menneskelig patologi.

Målet for pulmonal avlevering av aerosoliserte LPS som er beskrevet her, er å generere en nøytrofil inflammatorisk respons i det ledende og luftveiene, uten systemiske reaksjoner. Flere teknikker for LPS utfordringen har vært beskrevet tidligere. Intra-venøs injeksjon av LPS er den mest brukte administrasjonsmåte. Selv om denne teknikken er lett tilgjengelig, tHan primære skaden er til endotelet, med sekundær ødeleggelse av lunge epitel følgende nøytrofil migrering til lungen. Intra-venøs administrering induserer også systemisk inflammasjon ^2, noe som kan komplisere det kliniske bildet i dyremodeller. Systemisk inflammasjon er i motsetning ikke observert med intratrakeal administrering. Denne teknikk er imidlertid arbeidskrevende og krever anestetika samt betydelig trening ^{5, 6.} Videre er lunge deponering av denne administrasjons avhengig puste ^7. Således er lungeavsetning påvirkes av anestesidybden som er nødvendig for intra tracheal administrering og variabel deponering i luftveiene kan observeres. I motsetning til dette, med aerosolis LPS pulmonal levering krever minimal opplæring, og kan lett oppnås på et stort antall av dyr med liten eller ingen variasjon mellom individer ^{5, 8.}En fersk studie bekrefter at aerosol levering er overlegen den intratrakealt med hensyn til deponering, og at mer relevante doser av LPS indusere nøytrofil inflammasjon med denne modellen ^8.

Tidligere studier har vist at utfordring å aerosoliseres Pseudomonas aeruginosa LPS genererer en markert inflammatorisk respons i luftveislumen og lunge parenchyma, inkludert de alveolare rom ^{9, 10.} Betennelsen er preget av en overvekt av nøytrofile og tilstedeværelse av lungeødem, og kan dermed brukes til å adressere patogenesen av akutt lungeskade og få ytterligere kunnskap om mekanismene som bidrar til sykdom patologi.

Protocol

De dyrestudier ble godkjent av Northern Stockholm dyrevelferds etikkomité. De eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med svensk lov. 1. Generere en LPS Aerosol Oppløse 0,5 g renset P. aeruginosa LPS i 50 ml sterilt saltvann med forsiktig omrøring og verifisere oppløsning. Fortynn 1 ml LPS oppløst i 9 ml sterilt saltvann til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Beskytt mot lys med aluminiumsfolie og oppbevar ved -20 ° C. Tine oppløseliggjorte LPS…

Representative Results

Utfordring til aero P. aeruginosa LPS gir vanligvis en markert inflammatorisk respons i luftveislumen og alveolar plass, karakterisert ved en overvekt av nøytrofiler på både tidlige og sene tidspunkter. Aerosoliseres LPS induserer lunge neutrofili C57BL / 6BY og BALB / c mus ble utsatt for aerosolisert P. aeruginosa LPS eller bærer alene, og nøytrofiler ble nummerert i Balf. Det totale celletall i Balf av C57BL / 6BY mus eksponert for en aeros…

Discussion

Aero LPS genererer en inflammatorisk respons i luftveiene, kjennetegnet ved neutrofiler i epithelial submucosa, mellomrom som omgir de ledende luftveier, så vel som de alveolære områder. Dette er, sammen med den økte totale proteininnhold i Balf, en indikasjon på plasmalekkasje, er representative for patologien av akutt lungeskade. Som LPS induserer en steril inflammasjon, er reaksjonen uavhengig av den adaptive immunrespons, og det er begrensninger i relevans for bakterielle infeksjoner. Teknikken kan imidlertid b…

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.