Spinal Cord transection i larvestadiet zebrafisk

Summary

Efter spinal transection, voksne zebrafisk har funktionelle opsving seks uger efter skaden. At drage fordel af larvernes gennemsigtighed og hurtigere helbredelse, præsenterer vi en metode til transecting larve rygmarven. Efter transektion, observere vi sensorisk opsving begynder ved 2 dage efter skade, og C-bøjning bevægelse ved 3 dage efter skaden.

Abstract

Pattedyr mislykkes i sensoriske og motoriske restitution efter rygmarvsskade på grund af manglende axonal genvækst under niveauet for skade samt en manglende evne til reinitiere spinal neurogenesis. Men nogle anamniotes herunder zebrafisk Danio rerio udviser både sensoriske og funktionel genopretning, selv efter fuldstændig transection af rygmarven. Den voksne zebrafisk er en etableret model organisme for at studere regeneration efter rygmarvsskade, med sensoriske og motoriske inddrivelse ved 6 uger efter skaden. At drage fordel af in vivo analyse af den regenerative proces til rådighed i gennemsigtig larve zebrafisk samt genetiske værktøjer ikke tilgængelig i den voksne bruger vi larve zebrafisk at studere regenereringen efter rygmarv transection. Her demonstrerer vi en metode til reproducerbar og verificerbar transecting larve rygmarven. Efter transektion, vores data viser, sensoriske recovery begyndelsen på 2 dage efter skaden (dpi), with C-bøjning bevægelse påvises ved 3 dpi og genoptagelse af fri svømning med 5 dpi. Således foreslår vi larve zebrafisk som en følgesvend værktøj til den voksne zebrafisk for studiet af restitution efter rygmarvsskade.

Introduction

Større traumer til human rygmarv resulterer ofte i permanent lammelse og tab af følelse under niveauet for skade på grund af den manglende evne til at gro axoner eller reinitiere neurogenese ^1,2. I modsætning til pattedyr dog anamniotes herunder salamandre og zebrafisk (Danio rerio) viser robust opsving, selv efter fuldstændig rygmarv transection ^3,4.

Den voksne zebrafisk er en veletableret model for at studere helbredelsesprocessen efter rygmarvsskade ^5-7. Efter komplet rygmarv transektion observeres reetablering af sensoriske og lokomotiv funktion i den voksne zebrafisk med 6 uger efter skaden ^8. For at undersøge den regenerative proces in vivo, vi henvendte os til den gennemsigtige larve zebrafisk ^9.

Her præsenterer vi en metode til at transektere rygmarven af ​​en 5 dage efter befrugtning (DPF) larve zebrafisk using en skrå mikroinjektion pipette som en skalpel, modificeret fra Bhatt, et al. ^10. Denne metode understøtter høj kapacitet, lav dødelighed, og reproducerbarhed. Med praksis, kan 300 larver / h transected, og over 6 måneders transections, herunder mere end 3.600 dyr, 98,75% ± 0,72% overlevet indtil 7 dage efter skaden (dpi). Vores data viser hurtig genopretning af sensoriske og bevægelse samt: ved 1 dpi, bliver alle bevægelser af den forurettede fisk drevet af kun brystfinne bevægelse. , Larver begynder imidlertid at reagere på wolfram nål røre caudale til transektion med 2 dpi, genetablere C-bøjning bevægelse med 3 dpi, og vise aggressiv svømning med 5 dpi ^11. Brug antistoffarvning mod acetyleret tubulin, har vi bekræftet, at axoner er fraværende fra skaden site ved 1 dpi, men har krydset skaden site med 5 dpi. Vi mener, at denne protokol vil give en værdifuld teknik til studiet af axonal genvækst og neurogenese i rygmarven efter skade. </p>

Protocol

Zebrafisk er blevet rejst og opdrættet ifølge standardprocedurer; eksperimenter blev godkendt af University of Utah Institutional Animal Care og brug Udvalg. 1.. Udarbejdelse af Kirurgi Plates Gør kirurgi plader ved hjælp 60 mm petriskåle og Sylgard 184 Silikone Elastomer Kit, efter producentens anvisninger. Fyld retter ikke mere end halvt fyldt, og tillade at polymerisere. Opbevares dækket ved stuetemperatur. 2. Fremstilling af Mikropipetter…

Representative Results

For at reducere alvoren af vævsbeskadigelse omkring skaden site, korrekt beveling mikropipetten er kritisk. Figur 1A viser en korrekt affaset spids. Ved hjælp af et tip, der er for bred (figur 1B) har tendens til at resultere i højere dødsfald på grund af den øgede sandsynlighed for nicking dorsale aorta, mens et tip, der er for snæver (figur 1C) har tendens til blik væk fra huden snarere end at skære væv. At praktisere denne tekni…

Discussion

Ved første lære denne teknik, anbefaler vi forsøger ikke mere end 50-100 transections i en enkelt session. Efter mastering denne teknik, er vi i stand til at transektere op til 300 embryoner pr time; Men dette niveau af gennemløb kræver et par måneder af ugentlige praksis. Vi anbefaler også øve med en reporter linje og kontrollere fuldstændig overskæring indtil forekomsten af ​​ufuldstændig rygmarv overskæring reduceres til mindre end 1%.

Rygmarv transection i den voksne zebr…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
60mm petri dish	VWR	82050-544
100mm petri dish	VWR	89038-968
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
disssection microscope	Nikon	SMZ6454
microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C
Tricaine	Acros Organics	118000100
cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1ml syringe	BD	309625
27 ga. needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20°C
micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1L)			store at RT
17.5g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10ml)			make fresh, discard extra
0.35g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1L)			store at RT
50ml 20x E2
2ml fresh 500x NaCO3