Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi
Summary
Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.
Abstract
Memeliler nedeniyle yaralanma seviyesinin altında aksonal yeniden büyüme eksikliği yanı sıra spinal nöron yeniden başlatmak için bir yetersizlik omurilik yaralanması aşağıdaki duyusal ve motor kurtarma başarısız. Ancak, hatta omurilik tam kesilerinden sonra duyusal ve fonksiyonel iyileşme hem Zebrafish Br.rerio sergi olmak üzere bazı anamniotes. Yetişkin zebrabalıkları 6 hafta sonrası yaralanma ile duyusal ve motor iyileşme ile, omurilik yaralanmasının ardından rejenerasyon eğitim için kurulmuş bir model organizmadır. Saydam larva zebrabalıkları mevcut rejeneratif işleminin in vivo analiz avantajı hem de yetişkin genetik araçlar erişilemiyor almak için, omurilik transeksiyonu sonra rejenerasyon çalışma larva zebrafish kullanın. Burada yeniden üretilebilir ve verifiably larva omurilik bölücü için bir yöntem ortaya koymaktadır. Transeksiyon sonra, veri 2 gün sonrası yaralanma (dpi) duyusal kurtarma başlangıcını gösterir, zekâh 3 dpi ve 5 dpi tarafından ücretsiz yüzme sürdürme saptanabilen C-bend hareketi. Böylece omurilik yaralanması sonrası kurtarma çalışmaları için yetişkin Zebra balığı bir arkadaşı aracı olarak larva Zebra balığı öneriyoruz.
Introduction
Insan omurilik büyük travma nedeniyle sık sık aksonlar regrow veya nörogenezi 1,2 yeniden başlatmak için yetersizlik, kalıcı felç ve yaralanma seviyesinin altında duyu kaybı ile sonuçlanır. Memelilerde aksine, ancak, semenderler ve Zebra balığı (Br.rerio) dahil anamniotes bile tam omurilik kesisi 3,4 sonra sağlam iyileşme göstermektedir.
Yetişkin zebrabalıkları omurilik yaralanması 5-7 aşağıdaki kurtarma işlemini incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Tam omurilik kesisi sonrası, duyusal ve lokomotif işlevi yeniden kurulması 6 hafta sonrası yaralanma 8 ile yetişkin zebrabalıkları görülmektedir. In vivo olarak rejeneratif proses incelemek amacıyla, şeffaf larva zebrabalıkları 9 döndü.
Burada bir 5 gün sonrası fertilizasyon (DPF) larva Zebra balığı USI ve omurilik transect için bir yöntem mevcutBhatt değiştirilmiş bir neşter gibi bir eğimli mikroenjeksiyon pipet, ng vd. 10. Bu yöntem, yüksek verim, düşük mortalite ve tekrarlanabilirlik destekler. Uygulama ile, 300 larva / saat nakledilmiş olabilir, ve 98.75% 0.72% ± 3.600 üzerinde hayvanlar dahil kesilerde 6 aydan fazla, 7 gün sonrası yaralanma (dpi) kadar yaşadı. Bizim veri de duyusal ve hareket hızlı iyileşme gösterir: 1 dpi, yaralı balıklar tarafından tüm hareketleri sadece göğüs yüzgeci lokomosyon tarafından tahrik edilmektedir. Ancak, larva 2 dpi tarafından transection iğne dokunmatik caudal tungsten yanıt başlar, 3 dpi tarafından C-bend hareketini yeniden ve 5 dpi 11 ile yırtıcı yüzme gösterilecek. Asetilenmiş tübülinin karşı antikor boyama kullanarak, aksonlar 1 dpi yaralanma sitesinden bulunmadığına olduğunu doğruladı, ancak 5 dpi tarafından yaralanma siteyi geçti. Biz bu protokol aşağıdaki yaralanma omurilik aksonal yeniden büyüme ve nöron çalışma için değerli bir teknik sağlayacağına inanıyorum. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Başlangıçta bu tekniği öğrenirken, biz tek bir seansta en fazla 50-100 den kesilirken teşebbüs öneririz. Bu tekniği mastering sonra, saat başına 300 embriyo kadar transect edebiliyoruz; Ancak, üretilen bu düzeyde haftalık uygulama birkaç ay gerektirir. Ayrıca, bir raportör çizgi ile uygulama ve eksik omurilik kesisi sıklığı% 1'den daha az azalır kadar tamamen kesilmesini doğrulanması önerilir.
Yetişkin zebrafish omurilik hasarı sonrası transseksiyon akson b?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz hayvancılık için Utah Üniversitesi Zebrafish tesisine borçluyuz. RID NIH R56NS053897 tarafından desteklenen ve LKB HHMI Med-içine-Grad girişimi tarafından desteklenen bir predoctoral stajyer oldu.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
