Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris
Summary
Dans la transfection in vivo d'ADN nu par la délivrance de gènes hydrodynamique introduit les gènes dans le tissu d'un animal avec une réponse inflammatoire minime. Des quantités suffisantes de produit du gène sont générées de telle sorte que la fonction des gènes et de la réglementation ainsi que la structure et la fonction des protéines peuvent être analysées.
Abstract
L'expression efficace de transgènes in vivo est d'une importance critique pour l'étude de la fonction génique et le développement de traitements pour des maladies. Au cours des dernières années, la livraison de gène hydrodynamique (DHG) a émergé comme une méthode simple, rapide, sûr et efficace pour fournir des transgènes dans les rongeurs. Cette technique repose sur la force générée par l'injection rapide d'un grand volume de solution physiologique pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires des organes perfusés et ainsi délivrer de l'ADN dans les cellules. L'un des principaux avantages de HGD est la possibilité d'introduire des transgènes dans des cellules de mammifère en utilisant l'ADN plasmidique nu (ADNp). L'introduction d'un gène exogène en utilisant un plasmide est peu laborieux, très efficace et, contrairement aux transporteurs virales, remarquablement sûr. HGD a été initialement utilisé pour délivrer des gènes dans des souris, il est maintenant utilisé pour délivrer une large gamme de substances, y compris des oligonucleotides, des chromosomes artificiels, des ARN, des protéines et de petites molécules dans des souris, des ratset, à un degré limité, d'autres animaux. Ce protocole décrit HGD chez la souris et se concentre sur trois aspects clés de la méthode qui sont essentiels à l'exécution de la procédure avec succès: une bonne insertion de l'aiguille dans la veine, le volume d'injection et la rapidité de livraison. Des exemples sont donnés pour montrer l'application de cette méthode pour l'expression transitoire de deux gènes qui codent pour des protéines sécrétées, des primates-spécifique, l'apolipoprotéine LI (apoL-I) et la protéine apparentée à l'haptoglobine (HPR).
Introduction
Depuis sa première description par Liu et al. Et Zhang et al., La livraison de gène hydrodynamique (DHG) est devenu un outil précieux pour étudier la fonction des gènes dans des systèmes modèles de rongeurs 1, 2. La technique implique l'injection rapide (7.5 sec) d'un volume important (12.8% de poids corporel) de la solution dans la veine caudale de souris afin de faciliter l'absorption de l'ADN plasmidique par des cellules d'organes cibles 1, 2. Ces conditions conduisent à l'expression des gènes dans le foie robuste et moins l'expression du gène dans le rein, la rate, les poumons et le cœur.
Injection de 10 pg pCMV-LacZ plasmide peut transfecter autant que 40% des hépatocytes, ce qui HGD non-virale, la méthode la plus efficace, in vivo livraison de gène à la date 1. Contrairement transporteurs virales, pDNA est facile à préparer, ne provoque pas une réponse immunitaire chez l'hôte rongeur 3 et ne pose pas de risque pour la santé par se recombiner avec finvirus exogène. En outre, puisque les molécules d'ADN fournis par HGD n'ont pas besoin de l'emballage, cette méthode est adaptée pour la livraison de chromosomes artificiels de bactéries (BAC) aussi grandes que 150 ko 4. D'autres types de molécules qui ont été délivrés par un procédé hydrodynamique comprennent l'ARN de 5 à 10, 11 morpholinos, des protéines de 12, 13 et d'autres petites molécules 12, 14. Les avantages et les inconvénients de HGD sur les autres méthodes de livraison ont été abordés dans d'excellentes critiques dans la littérature 15-20 et un certain nombre d'auteurs ont fourni une description détaillée de la procédure 21-23.
L'introduction de transgènes dans des souris par le MH est sûr et efficace 1-3, 24 et le procédé a été utilisé avec succès chez des rats comparable 25. Avec certaines modifications, des expériences de validation de concept ont été réalisées chez les poulets, 26 rables bits 27 et 28 porcs, bien que, l'application in vivo de cette technique dans les plus grands animaux reste un défi. Lorsqu'on utilise ce procédé, une autre limitation commune est que la plupart des vecteurs d'expression mammaliens disponibles ne disposent pas des composants pour atteindre une persistante, le niveau élevé de l'expression génique. L'utilisation d'un plasmide, l'expression du gène pCMV-Luc dans les organes cibles est évident dès dix minutes après HGD, toutefois, le niveau d'expression initial, haute diminue fortement dans la première semaine après l'injection 1. L'expression du transgène à long terme est possible selon le promoteur et l'intron utilisés dans la conception de plasmide 3, 24 injections Toutefois, le maintien de l'expression du gène de haut niveau nécessite souvent répété. Pour cette raison, HGD peut-être moins approprié pour étudier les maladies chroniques qui sont le résultat de l'exposition à long terme à des protéines nuisibles ou des produits protéiques. Avec ces limitations, HGD est un outil extrêmement puissant pour étudier la potiel rôle d'un gène et l'effet de celle des mutants in vivo, ainsi que les effets thérapeutiques et la régulation des protéines et pour établir des modèles animaux de la maladie (pour revue, voir 15). Par exemple, HGD peut être utilisée pour affecter la fonction des domaines et des acides aminés des protéines en introduisant individuellement différentes constructions de gènes dans les souris qui ont les gènes respectifs assommé. En outre, cette technique peut être utilisée dans n'importe quelle souche de souris.
Ce protocole décrit HGD chez la souris avec un accent sur les aspects techniques nécessaires à la réalisation transfection réussie: insertion correcte de l'aiguille dans la veine, le volume d'injection et la rapidité de livraison. L'application de cette méthode est démontrée dans un modèle de souris de la trypanosomiase africaine, une maladie mortelle de l'homme et de l'élevage 29, 30. Bien que plusieurs espèces de trypanosomes causent la maladie chez le bétail, la plupart ne peuvent pas provoquer la maladie chez l'homme due à des complexes immuns innés en blood appelées facteurs lytiques des trypanosomes (TLF) 29, 31, 32. Ces, lipoprotéines de haute densité formation de pores (HDL) contiennent deux protéines, les primates spécifique uniques:. HPR, le ligand de, ce qui facilite l'absorption de TLF dans les trypanosomes, et PALO-I, le composant lytique 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense est capable d'infecter les êtres humains en raison de l'expression d'une protéine associée à la résistance de sérum (SRA) qui se lie à et neutralise apoL-I humain 34, 39. Baboon TLF n'est pas neutralisé par SRA en raison de sa divergent protéine PALO-I 40. Comme indiqué précédemment, en utilisant un vecteur d'expression de mammifère (pRG977), l'expression transgénique de babouin composants TLF chez la souris confère une protection contre les trypanosomes humains-infectieux 40. Les données représentatives présentées ici montrent comment la délivrance de gènes hydrodynamique peut être appliquée pour étudier les effets thérapeutiques d'une protéine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quand elle est réalisée correctement, HGD est un moyen remarquablement efficace et sans danger de la livraison du transgène. Les étapes essentielles à la réussite de HGD sont: 1) fournir la bonne quantité d'ADN dans un grand volume d'eau salée véhicule 2) dans la veine de la queue de la souris 3) en moins de 8 secondes.
Bien que le processus d'injection elle-même exige indéniablement une certaine dextérité manuelle, le succès de cette deuxième procédure de six ré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) pour d'abord nous enseigner la technique HGD et le Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) pour son orientation permanente dans divers aspects de la technologie. Ce travail a été financé par Hunter College, CUNY fonds de démarrage et d'attribution NSF pain IOS-1249166. Nous remercions la subvention d'appui NYULMC histopathologie base NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 pour l'histologie sur des foies de souris.
Materials
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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