चूहे में द्रव्यगतिकी जीन डिलीवरी द्वारा प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति

Summary

Hydrodynamic जीन डिलीवरी द्वारा नग्न डीएनए के vivo अभिकर्मक में कम से कम भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ एक पशु के ऊतकों में जीनों का परिचय. जीन उत्पाद के लिए पर्याप्त मात्रा में जीन समारोह और विनियमन के साथ ही प्रोटीन संरचना और समारोह का विश्लेषण किया जा सकता है कि इस तरह उत्पन्न कर रहे हैं.

Abstract

विवो में transgenes की कुशल अभिव्यक्ति जीन समारोह का अध्ययन और रोगों के उपचार को विकसित करने में महत्वपूर्ण महत्व का है. पिछले वर्षों में, hydrodynamic जीन डिलीवरी (HGD) कृन्तकों में transgenes देने के लिए एक सरल, तेज, सुरक्षित और प्रभावी तरीके के रूप में उभरा है. इस तकनीक perfused अंगों की कोशिका झिल्ली की पारगम्यता बढ़ाने के लिए शारीरिक समाधान की एक बड़ी मात्रा का तेजी से इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न बल पर निर्भर करता है और इस प्रकार की कोशिकाओं में डीएनए उद्धार. HGD का मुख्य लाभ में से एक नग्न प्लास्मिड डीएनए (pDNA) का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं में transgenes शुरू करने की क्षमता है. एक प्लाज्मिड का उपयोग कर एक exogenous जीन परिचय उल्लेखनीय सुरक्षित, न्यूनतम अत्यधिक कुशल, श्रमसाध्य और वायरल वाहक के विपरीत है. HGD शुरू में चूहों में जीन देने के लिए इस्तेमाल किया गया था, यह अब oligonucleotides, कृत्रिम क्रोमोसोम, शाही सेना, प्रोटीन और चूहों में छोटे अणुओं सहित पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला, चूहों देने के लिए प्रयोग किया जाता हैऔर, एक सीमित हद तक अन्य जानवरों. इस प्रोटोकॉल चूहों में HGD वर्णन करता है और सफलतापूर्वक प्रक्रिया के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं कि विधि के तीन प्रमुख पहलुओं पर केंद्रित है: नस में सुई की सही प्रविष्टि, इंजेक्शन की मात्रा और वितरण की गति. उदाहरण स्रावित, रहनुमा विशेष प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि दो जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए इस विधि के आवेदन को दिखाने के लिए दिया जाता है, अपोलीपोप्रोटीन ली (Apol मैं) और haptoglobin से संबंधित प्रोटीन (HPR).

Introduction

द्वारा अपनी पहली विवरण के बाद लियू एट अल. और झांग एट अल., Hydrodynamic जीन डिलीवरी (HGD) कृंतक मॉडल प्रणाली ^{1, 2} में जीन समारोह के अध्ययन के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है. तकनीक लक्ष्य अंगों ^{1, 2} की कोशिकाओं से डीएनए प्लाज्मिड के तेज की सुविधा के लिए चूहों की पूंछ नस में समाधान की एक बड़ी मात्रा (8-12% शरीर के वजन) के तेजी से इंजेक्शन (5-7 सेकंड) शामिल है. इन शर्तों गुर्दा, तिल्ली, फेफड़े और दिल में जिगर और कम जीन अभिव्यक्ति में मजबूत जीन की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व.

10 माइक्रोग्राम pCMV-lacZ प्लाज्मिड इंजेक्शन HGD तारीख ¹ सबसे कुशल, गैर वायरल, vivo जीन वितरण पद्धति है, जिससे hepatocytes के रूप में ज्यादा के रूप में 40% transfect कर सकते हैं. वायरल वाहक के विपरीत, pDNA तैयार करने के लिए आसान है, कृंतक मेजबान ³ में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना नहीं करता है और अंत के साथ पुनर्संयोजन द्वारा एक स्वास्थ्य खतरा उत्पन्न नहीं करताogenous वायरस. HGD ने दिया डीएनए अणु पैकेजिंग की जरूरत नहीं है, क्योंकि इसके अलावा, इस विधि 150 केबी के रूप में ⁴ के रूप में बड़े जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) की डिलीवरी के लिए उपयुक्त है. एक hydrodynamic विधि द्वारा दिया गया है कि अणुओं के अन्य प्रकार शाही सेना ^5-10, morpholinos ^11, प्रोटीन ^{12, 13} और अन्य छोटे अणुओं ^{12, 14} में शामिल हैं. अन्य प्रसव के तरीके से अधिक HGD के फायदे और नुकसान साहित्य ^15-20 में उत्कृष्ट समीक्षा में चर्चा की गई है और लेखकों में से एक नंबर प्रक्रिया ^21-23 का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराई है.

HGD द्वारा चूहों में transgenes परिचय सुरक्षित और ^{1-3, 24} से प्रभावी है और विधि तुलनीय सफलता ²⁵ के साथ चूहों में इस्तेमाल किया गया है. कुछ संशोधनों के साथ, सबूत की अवधारणा प्रयोगों मुर्गियों ^26, रब में बाहर किया गया हैबड़े जानवरों में इस तकनीक के vivo आवेदन एक चुनौती बनी हुई है, हालांकि, ²⁷ और सूअरों ²⁸ बिट्स. इस पद्धति का उपयोग करते हैं, तो एक और सामान्य सीमा उपलब्ध स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर के कई जीन अभिव्यक्ति का एक लगातार उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए घटकों की कमी है. लक्ष्य अंगों में एक pCMV ल्यूक प्लाज्मिड, जीन अभिव्यक्ति का उपयोग हालांकि, प्रारंभिक, उच्च अभिव्यक्ति के स्तर इंजेक्शन ¹ के बाद पहले सप्ताह में तेजी से चला जाता है, HGD के बाद दस मिनट के रूप में जल्दी के रूप में स्पष्ट है. लंबे समय तक transgene अभिव्यक्ति प्लाज्मिड डिजाइन ^{3, 24} बहरहाल, उच्च स्तर के जीन की अभिव्यक्ति के रखरखाव अक्सर दोहराया आवश्यकता इंजेक्शन में इस्तेमाल प्रमोटर और Intron के आधार पर संभव है. इस कारण से, HGD हानिकारक प्रोटीन या प्रोटीन उत्पादों के लिए लंबी अवधि के निवेश का एक परिणाम हैं कि पुराने रोगों का अध्ययन करने के लिए कम उपयुक्त हो सकता है. इन सीमाओं के साथ, HGD पीओ के अध्ययन के लिए एक असाधारण शक्तिशाली उपकरण हैएक जीन और यह के प्रभाव की क्षमता का भूमिका (समीक्षा के लिए, ¹⁵ देखें) विवो, साथ ही चिकित्सीय प्रभाव और प्रोटीन के नियमन में और रोग के पशु मॉडल की स्थापना के लिए म्यूटेंट. उदाहरण के लिए, HGD व्यक्तिगत रूप से संबंधित जीन बाहर दस्तक दी है कि चूहों में विभिन्न जीन निर्माणों को शुरू करने से डोमेन और प्रोटीन के अमीनो एसिड के लिए समारोह आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक को किसी भी माउस तनाव में इस्तेमाल किया जा सकता है.

वितरण की नस, इंजेक्शन की मात्रा और गति में सही सुई प्रविष्टि: इस प्रोटोकॉल सफल अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए आवश्यक तकनीकी पहलुओं पर ध्यान देने के साथ चूहों में HGD वर्णन करता है. इस विधि के आवेदन अफ्रीकी trypanosomiasis, मनुष्यों की एक घातक रोग और पशुधन ^{29, 30} के एक माउस मॉडल में प्रदर्शन किया है. Trypanosomes की कई प्रजातियों के पशुओं में रोग का कारण हैं, सबसे ख में प्रतिरक्षा परिसरों जन्मजात की वजह से मानव में बीमारी का कारण नहीं कर सकतेlood बुलाया असिकाय अपघट्य कारकों (TLFs) ^{29, 31, 32.} ये ताकना के गठन, उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल) दो अद्वितीय, रहनुमा विशेष प्रोटीन होते हैं. Trypanosomes में TLFs के तेज जो सुविधा HPR, ligand,, और Apol-मैं, अपघट्य घटक ^{31, 33-38} ट्रिपैनोसोमा ब्रुसे rhodesiense के कारण बांध और मानव Apol-मैं ^{34, 39} neutralizes कि एक सीरम प्रतिरोध जुड़े प्रोटीन (एसआरए) की अभिव्यक्ति के लिए मनुष्यों को संक्रमित करने में सक्षम है. लंगूर TLF कारण इसकी मुक़्तलिफ़ Apol-I प्रोटीन ^{से 40} एसआरए द्वारा निष्प्रभावी नहीं है. एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर (pRG977), चूहों में लंगूर TLF घटकों के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए, जैसा कि पहले बताया मानव संक्रामक trypanosomes ⁴⁰ के खिलाफ संरक्षण प्रदान करता है. यहाँ प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा hydrodynamic जीन डिलीवरी एक प्रोटीन की चिकित्सीय प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है.

Protocol

यहाँ वर्णित सभी प्रयोगों हंटर कॉलेज के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, न्यूयॉर्क के सिटी विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया. Endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए के 1. तैयारी एक हौसले स…

Representative Results

माउस की पूंछ नस में सुई की सही स्थिति (चित्रा 1 में सचित्र) सफलतापूर्वक हाइड्रोइनेमिकस आधारित अभिकर्मक से एक transgene पहुंचाने के लिए एक शर्त है. इंजेक्शन की पूरी मात्रा एक 6-8 की अवधि के भीतर दिया जा सकत?…

Discussion

सही ढंग से प्रदर्शन करते हैं, तो HGD transgene प्रसव के एक उल्लेखनीय सुरक्षित और कारगर साधन है. सफल HGD के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) कम से कम 8 सेकंड में माउस 3) की पूंछ नस में) खारा वाहन 2 की एक बड़ी मात्रा में डीएनए की स?…

Materials

Alcohol Prep Wipe	Webcol	6818
AST kit, Amplite Colorimetric	AAT Bioquest	13801
Conical Tube, 50 ml	BD Falcon	352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
KimWipes	KIMTECH	34120
Mouse Tail Illuminator	Braintree Scientific	MTI RST	Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)	BD	305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)	BD	305109
pRG977 (mammalian expression vector)	Regeneron Pharmaceuticals		Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira	Fisher	NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip	BD	309657	Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD