تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي
Summary
ووصف الأسلوب مع مرافقة البصرية لإجراء قابلة لل، التحديدات إنتاجية عالية من اندماجي المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية عرض فج ضد المئات من مولدات المضادات في وقت واحد. باستخدام هذا النهج الموازي، ونحن قد عزل شظايا الأجسام المضادة التي تظهر تقارب عالية وخصوصية لمستضدات المتنوعة التي وظيفية في المناعية القياسية.
Abstract
الطلب على الأجسام المضادة التي تلبي احتياجات كل من تطبيقات البحوث الأساسية والسريرية عالية، وسوف تزيد بشكل كبير في المستقبل. ومع ذلك، فمن الواضح أن التقنيات التقليدية ليست وحيدة النسيلة وحدها تصل إلى هذه المهمة. وقد أدى ذلك إلى تطوير أساليب بديلة لتلبية الطلب على جودة عالية والكواشف تقارب المتجددة لجميع العناصر يمكن الوصول إليها من بروتيوم. ولتحقيق هذه الغاية، وقد وضعت أساليب إنتاجية عالية لإجراء مختارات من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية عرض فج للتطبيقات التي تنطوي على مستضدات متنوعة والأمثل لإنتاجية السريع والنجاح. هنا، يتم وصف بروتوكول في التفاصيل التي توضح مع مظاهرة الفيديو اختيار موازية من الحيوانات المستنسخة فاب-فج من المكتبات التنوع عالية ضد مئات الأهداف باستخدام معالج السائل اليدوي 96 قناة أو النظام الآلي الروبوتات. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن لمستخدم واحد تولد المئات من مولدات المضادات،تحديد الأجسام المضادة لهم بالتوازي والتحقق من صحة الأجسام المضادة ملزمة في غضون 6-8 أسابيع. يسلط عليها الضوء هي: ط) شكل مستضد قابلة للحياة، والثاني) توصيف مستضد الاختيار، الثالث) الخطوات الحاسمة التي تؤثر في اختيار من الحيوانات المستنسخة محددة وعالية تقارب، والرابع) سبل فعالية اختيار رصد ومرحلة مبكرة الأجسام المضادة استنساخ التوصيف. مع هذا النهج، لقد حصلنا على شظايا الأجسام المضادة الاصطناعية (فابز) إلى العديد من الفئات المستهدفة بما في ذلك مستقبلات غشاء مسار واحد، الهرمونات تفرز بروتين، والبروتينات داخل الخلايا متعددة المجالات. يتم تحويل هذه الشظايا بسهولة إلى الأجسام المضادة كامل طول وتم التحقق من صحة لعرض تقارب عالية وخصوصية. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت لتكون وظيفية في مجموعة متنوعة من المناعية القياسية بما في ذلك غرب النشاف، ELISA، المناعي الخلوي، مناعي وفحوصات ذات الصلة. وهذه المنهجية تسريع اكتشاف الأجسام المضادة، وفي نهاية المطاف يقربنا من تحقيق هدف سو توليد الطاقة المتجددة، والأجسام المضادة ذات جودة عالية للبروتيوم.
Introduction
مع بداية عصر ما بعد الجينوم، وتوافر الكواشف ملزمة عالية الجودة لتوصيف وتعدل البروتينات ضروري لفتح البحوث الجديدة والسبل العلاجية. تستمر الأجسام المضادة لتكون حاسمة لكلا الباحثين الأكاديميين والصناعية، والبحوث الأساسية وأدوات التشخيص والعلاجات المحتملة. ليس من المستغرب، فقد كان هناك نمو هائل من شركات تطوير الأجسام المضادة العقد، ومعظمها تعتمد على التقنيات التقليدية هجين لتوليد الأجسام المضادة مخصصة. ومع ذلك، في المختبر التحديد باستخدام مكتبات الضد-عرض فج أصبحت تكنولوجيا بديلة قوية يمكن أن توفر مزايا فريدة والنجاح حيث التقنيات التقليدية يمكن أن تواجه القيود 1 و 2.
في ضوء طلب كبير على الأجسام المضادة ذات جودة عالية كما أدوات البحث، وهما التحديات الرئيسية لتوليد الأجسام المضادة المتجددة هي 1) الإنتاجية الاختيار و2) مركبات مستضدailability. ووصف عدد من الجماعات الآن في خطوط الأنابيب اختيار المختبر تهدف إلى زيادة الإنتاجية ومعدل تحديد الأجسام المضادة. هذه الأوصاف بالتفصيل مجموعة متنوعة من النهج قابلة للحياة أن تشمل اختيار إما على كامل طول تستهدف 3،4، أو هيكليا المجالات 5،6،7 ذات الصلة، سواء باستخدام 6،8 أو 3،4 مخططات مستضد تجميد لوحة المستندة على أساس حبة. وبالإضافة إلى ذلك، حققت تزايد اعتماد تقنيات التوليف الجيني 9 جيل مستضد المنهجي، ولا سيما من المجالات معزولة، معقول فعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن يحتمل التخفيف من صعوبة في الحصول على كميات كافية من النقى كامل طول مستضد. باستخدام تقنيات اثنين جنبا إلى جنب، ولقد ابتكر خط أنابيب مكتفية ذاتيا وتوليد المستضدات تحجيم واختيار الأجسام المضادة التي من شأنها تمكين العزلة موازية من الأجسام المضادة لمجموعات كبيرة من المجالات المستضد أعرب وتسهيل تطوير الكاشف لتشاracterizing فئات كاملة من البروتينات المرتبطة هيكليا أو وظيفيا.
من أجل تحقيق هذا الهدف، وهو خط أنابيب المتكاملة التي تم تطويرها من الأزواج في تحديد سيليكون والمجالات مستضد التعبير عنه، والتوليف الجيني والتعبير البكتيرية عالية الإنتاجية من المستضدات وعرض فج التحديدات الأجسام المضادة قابلة للتطوير. هذا الخط يتطلب البنية التحتية الأساسية الوحيدة المتاحة لمعظم مختبرات علوم الحياة (بما في ذلك المكتبات الأجسام المضادة التي تكون متاحة على نحو متزايد من خلال ترخيص أو اتفاق نقل المواد)، ولكن هو أيضا قابلة للالتشغيل الآلي للاستخدام على نطاق صناعي. باستخدام هذا البروتوكول، فمن الممكن لتوليد مئات من المجالات مستضد الموسومة تقارب، وعزل روتيني شظايا الأجسام المضادة محددة للغاية لكثير من هذه المستضدات.
وقد أظهرت تكنولوجيا العرض فج التوافق تظاهر مع مجموعة واسعة من صيغ المؤتلف تقارب كاشف بما في ذلك القوات المسلحة البوروندية، scFv، والمجالات اناث مستقلة ومجموعة متزايدة من "الأطر البديلة" صغيرة (المصممة ankyrin تكرار البروتينات (DARPINS)، فبرونيكتين (الجبهة الوطنية)، وأكثر المجالات lipocalin 10). وتقتصر المناقشة في هذا المثال إلى عزل فاب شظايا الأجسام المضادة، على الرغم من أنه يفترض هذه الأساليب يمكن أن تتكيف مع أنواع أخرى من المكتبات. باستخدام هذه التكنولوجيا، فابز مع انخفاض nanomolar تقارب للمشاريع الصغيرة، الموسومة المجالات بما في ذلك المجالات بروتين عامل النسخ، المجالات SH2، وقد تم اختيار البروتينات وغيرها ملزم RNA بنجاح، وكثير منها ربط بروتين كامل طول ووظيفية في المناعية مثل المناعي ، مناعي والمناعية. الأهم من ذلك، استنساخ ملزمة المؤتلف قابلة للتجديد بالكامل ويمكن إعادة لدت-من التعبير يبني عبر البكتيرية طرح زيادة إنتاج الاتساق، استنساخ والفعالية من حيث التكلفة، وبالتالي تبرير حساب دقيق التحقق من صحة استنساخ.
في هذا البروتوكول الاضافيocol والفيديو المصاحب، وأثبتت الأساليب الأساسية لاختيار الأجسام المضادة من المكتبات عرض فج باستخدام المجالات مستضد يجمد. هذه طريقة معينة توظف المجالات البروتين الموسومة GST ثبتوا عن طريق الامتزاز السلبي في لوحات microwell، على الرغم من علامات أخرى 11،12،13 وصيغ اختيار 13،14،2 كما تم استخدامها بنجاح. الاعتبارات الهامة لإعداد وإجراء التحديدات مع مراقبة مواز من المعلمات اختيار تهدف إلى تحديد وعزل أجسام مضادة نسيلي المخصب خصيصا من أجل التحقق مفصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند إجراء التحديدات في الأجسام المضادة في المختبر، وهما المحددات الأساسية لنجاح الاختيار هي 1) عزل أهداف المستضدات مطوية جيدا لاختيار عليه و2) توفر وظيفية مكتبة تنوع الأجسام المضادة عالية. في كثير من الحالات، وتوافر كميات كافية من مطوية جيدا، بروتين كامل طو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعترف الصندوق المشترك NIH – البروتين القبض على الكواشف برنامج لتمويل التنمية في اختيار الأجسام المضادة وتوصيف خط أنابيب المؤتلف الضد الشبكة والمؤسسة الكندية للإبداع للشراء التمويل من منصة اختيار الروبوتية.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
