גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג
Summary
שיטה מתוארת בליווי חזותי לניהול בחירות להרחבה, תפוקה גבוהות מספריות נוגדן סינתטיות קומבינטורית-מוצג הפאג נגד מאות אנטיגנים בו-זמנית. שימוש בגישה זו במקביל, יש לנו מבודד שברי נוגדן שמפגינים זיקה גבוהה וספציפיות לאנטיגנים שונים כי הם פונקציונליים בimmunoassays הסטנדרטי.
Abstract
הביקוש לנוגדנים אשר עונה על הצרכים של שני יישומי המחקר הבסיסיים וקליניים הוא גבוה ויגדיל באופן דרמטי בעתיד. עם זאת, נראה כי טכנולוגיות חד שבטיים מסורתיות לא לבד עד למשימה זו. זה הוביל לפיתוח שיטות חלופיות כדי לספק את הביקוש באיכות גבוהה וחומרים כימיים זיקה מתחדשים לכל האלמנטים הנגישים של proteome. לשם כך, שיטות תפוקה גבוהות לביצוע בחירות מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג כבר המציאו עבור יישומים הכוללים אנטיגנים מגוונים ומותאמות לתפוקה ולהצלחה מהירות. במסמך זה, פרוטוקול מתואר בפירוט שממחיש עם הפגנת וידאו בחירה המקבילה של שיבוטים Fab-הפאג מספריות גיוון גבוהות נגד מאות יעדים או באמצעות מערכת רובוטיקה אוטומטית מטפל נוזלי ידני 96 ערוצים או. שימוש בפרוטוקול זה, משתמש יחיד יכול ליצור מאות אנטיגנים,בחר נוגדנים להם במקביל ולאמת את הנוגדן מחייב בתוך 6-8 שבועות. מודגש הם: i) פורמט אנטיגן קיימא, ii) אפיון אנטיגן מראש בחירה-, iii) שלבים קריטיים המשפיעים על הבחירה של שיבוטים זיקה מסוימים וגבוהים, וiv) דרכים אפקטיביות בחירת ניטור ואפיון שיבוט נוגדן שלב מוקדם. עם גישה זו, השגנו ברי נוגדן סינטטיים (Fabs) לכיתות יעד רבות, כולל קולטנים יחידים לעבור קרום, הורמונים מופרשים חלבון, וחלבונים תאיים רב-תחום. הם שברים אלה יומרו בקלות לנוגדנים באורך מלא ואומתו להציג זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, הם כבר הוכיחו להיות פונקציונליים במגוון רחב של immunoassays הסטנדרטי כולל מערבי סופג, ELISA, immunofluorescence הסלולרי, immunoprecipitation מבחני בנושא. מתודולוגיה זו תאיץ גילוי נוגדנים וסופו של דבר יביא אותנו קרוב יותר למימוש המטרה of יצירת נוגדנים מתחדשים, באיכות גבוהה לproteome.
Introduction
עם תחילתו של עידן פוסט-גנומי, הזמינות של חומרים כימיים המחייבים באיכות גבוהה לאפיין ולווסת את החלבונים חיונית כדי לפתוח מחקר חדש ושדרות טיפוליות. נוגדנים ימשיכו להיות גורלי לשני חוקרים האקדמיים ותעשייתיים כמחקר בסיסי וכלי אבחון ותרופות פוטנציאליות. באופן לא מפתיע, חל גידול מרשים של חברות פיתוח נוגדן חוזה, שרובם להסתמך על טכנולוגיות hybridoma קונבנציונליות כדי לייצר נוגדנים מותאמים אישית. עם זאת, בחירה במבחנה באמצעות ספריות נוגדנים המוצגות הפאג הופכת טכנולוגיה חלופית רבת עוצמה שיכול להציע יתרונות ייחודיים והצלחה בו יכולות טכנולוגיות קונבנציונליות עומדות בפני מגבלות 1, 2.
לאור הביקוש הרב לנוגדנים באיכות גבוהה כמו כלי מחקר, שני אתגרים עיקריים ליצירת נוגדנים מתחדשים הם 1 תפוקת בחירה) ו -2) av אנטיגןailability. מספר הקבוצות עכשיו תאר בצינורות בחירת מבחנה שמטרתן להגדיל את התפוקה ושיעור זיהוי נוגדן. פירוט תיאורים אלה מגוון של גישות קיימא שכוללים בחירה על שני באורך מלא מטרות 3,4, או מבני הקשורים תחומים 5,6,7, או באמצעות 6,8 או צלחת מבוססת 3,4 תוכניות קיבוע אנטיגן מבוסס חרוז. בנוסף, האימוץ הגובר של טכנולוגיות סינתזת גן 9 הפך את דור אנטיגן שיטתי, במיוחד של תחומים מבודדים, עלות סבירה יעיל ואף עלול להקל על הקושי בהשגת כמות מספקת של אנטיגן המטוהר, באורך מלא. על ידי שימוש בשתי הטכנולוגיות במקביל, צינור עצמאי ודור אנטיגן מדרגי ובחירת הנוגדן תוכנן שיאפשר הבידוד המקביל של נוגדנים לקבוצות גדולות של תחומים אנטיגן הביעו ולהקל על הפיתוח של חומרים כימיים לצ'הracterizing מחלקות שלמות של חלבונים מבני או תפקודי הקשורות.
לקראת מטרה זו, צינור משולב שזוגות בזיהוי סיליקו של תחומים אנטיגן לבטאו, סינתזת גן, ביטוי חיידקי תפוקה גבוה של אנטיגנים ונוגדני בחירות המוצגות הפאג מדרגי פותחו. צינור זה דורש תשתית רק בסיסית זמינה לרוב מעבדות מדעי החיים (כוללים ספריות נוגדן אשר זמינות יותר ויותר באמצעות הסכם רישיון או העברת חומר), אבל הוא גם נוח לאוטומציה לשימוש בקנה מידה תעשייתית. שימוש בפרוטוקול זה, ניתן ליצור מאות תחומים אנטיגן-מתויג זיקה, והבודד באופן שגרתי שברי נוגדן ספציפיים מאוד לרב של אנטיגנים אלה.
טכנולוגיית תצוגת הפאג הראתה תאימות הפגינה עם מגוון רחב של פורמטים מגיב זיקת רקומביננטי כולל Fab, scFv, ותחומים Fv אוטונומיים ומערך הולך וגדל של "מסגרות אלטרנטיביות 'קטנות (חלבונים שנועדו חוזרים ankyrin (DARPINS), פיברונקטין (Fn), תחומים lipocalin ועוד 10). דיון מוגבל בדוגמא זו לבידודה של שברי נוגדן Fab, למרות שהוא בחזקת יכולות להיות מותאמות בשיטות אלה לסוגים אחרים של ספריות. באמצעות טכנולוגיה זו, Fabs עם זיקה של ננו-מולר נמוך לקטן, מתויג תחומים חלבון כוללים תחומים גורם שעתוק, תחומים SH2, חלבונים ואחרים מחייבים RNA נבחר בהצלחה, שרבים מהם לקשור חלבון באורך מלא ופונקציונליים בimmunoassays כגון immunofluorescence , Immunoprecipitation ואימונוהיסטוכימיה. חשוב לציין, שיבוטים המחייבים רקומביננטי מתחדשים באופן מלא ויכולים להיות מחדש שנוצרו מביטוי בונה באמצעות הנפקת ייצור חיידקים גדל עקביות, שחזור ועלות-תועלת, ובכך מצדיק את ההוצאה של אימות שיבוט קפדני.
בprot זהocol ווידאו המצורף, שיטות בסיסיות לבחירת נוגדנים מספריות המוצגות הפאג השתמשו בתחומי אנטיגן משותקים הם הפגינו. שיטה מסוימת זו מעסיקה תחומים חלבון מתויג GST משותקים על ידי ספיחה פסיבית בצלחות microwell, למרות תגים אחרים 11,12,13 ופורמטי בחירה 13,14,2 גם שימשו בהצלחה. שיקולים קריטיים להגדרה וההתנהגות של בחירות עם ניטור מקביל של פרמטרים בחירת מטרתו לאתר ובידוד נוגדנים משובטים במיוחד מועשר לאימות מפורטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת ביצוע בבחירות נוגדן מבחנה, שני גורמים העיקריים להצלחה הם בחירת 1) הבידוד של מטרות אנטיגני מקופלות היטב לבחירה על ו -2) הזמינות של ספריית נוגדן גיוון תפקודית גבוהה. במקרים רבים, את הזמינות של כמויות מספיקות של מקופל היטב, חלבון באורך מלא יכולה להיות מגבילה. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות NIH Common הקרן – תכנית ריאגנטים לכידת חלבון למימון פעילות הפיתוח של נוגדן בחירה ואפיון צינור רשת נוגדן רקומביננטי והקרן הקנדית לחדשנות לרכישת מימון של הפלטפורמה רובוטית הבחירה.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
