Skalerbar høy gjennomstrømning Utvalg fra fag-vises Syntetiske antistoffbiblioteker
Summary
En metode er beskrevet med visuell akkompagnement for å gjennomføre skalerbare, høy gjennomstrømning valg fra fag-vises kombinatoriske syntetiske antistoffbiblioteker mot hundrevis av antigener samtidig. Ved hjelp av denne parallell tilnærmingen, har vi isolert antistoff-fragmenter som utviser høy affinitet og spesifisitet for forskjellige antigener som er funksjonelle i standard immunoanalyser.
Abstract
Etterspørselen etter antistoffer som oppfyller behovene til både grunnforskning og klinisk forskning programmer er høy og vil dramatisk øke i fremtiden. Det er imidlertid åpenbart at monoklonale tradisjonelle teknologier er ikke alene til denne oppgaven. Dette har ført til utvikling av alternative metoder for å tilfredsstille behovet for høy kvalitet og fornybare affinitet reagenser til alle tilgjengelige elementer av proteom-. Mot dette formål, har høy gjennomstrømming metoder for å gjennomføre valg fra fag-vises syntetiske antistoffbiblioteker blitt utviklet for applikasjoner som involverer ulike antigener og optimalisert for rask gjennomstrømming og suksess. Her, er en protokoll som er beskrevet i detalj som illustrerer med video demonstrasjon parallell utvalg av Fab-fagklonene fra høye mangfold biblioteker mot hundrevis av målene ved hjelp av enten en manuell 96 kanal væskebehandler eller automatisert robotsystem. Ved hjelp av denne protokollen, kan en enkelt bruker generere hundrevis av antigener,velg antistoffer mot dem i parallell og validere antistoffbinding innen 6-8 uker. Uthevet er: i) en levedyktig antigen format, ii) forhåndsvalg antigen karakterisering, iii) kritiske trinn som påvirker valg av konkrete og høye affinitet kloner, og iv) måter overvåking utvalg effektivitet og tidlig stadium antistoff klone karakterisering. Med denne tilnærmingen, har vi fått syntetiske antistoffragmenter (Fabs) til mange målgrupper klasser inkludert single-pass membranreseptorer, utskilt protein hormoner, og multi-domene intracellulære proteiner. Disse fragmentene blir lett omdannet til full-lengde antistoffer og har blitt validert for å fremvise høy affinitet og spesifisitet. Videre har de vist seg å være funksjonelle i en rekke standard immunoanalyser inkludert Western-blotting, ELISA, cellulær immunfluorescens, immunoutfelling og relaterte analyser. Denne metodikken vil akselerere antistoff funn og til slutt bringe oss nærmere å realisere målet of generere fornybare, høykvalitets antistoffer mot proteomet.
Introduction
Med utbruddet av den post-genomisk alder, er tilgjengeligheten av høy kvalitet bindingsreagenser å karakterisere og modulere proteiner viktig å åpne ny forskning og terapeutiske muligheter. Antistoffer fortsette å være kritisk til både akademiske og industrielle forskere som grunnforskning og diagnostiske verktøy og potensielle therapeutics. Ikke overraskende har det vært en imponerende vekst av kontrakt antistoffutvikling bedrifter, hvorav de fleste er avhengige av konvensjonelle hybridomceller teknologier for å generere egendefinerte antistoffer. Likevel er in vitro valg med fag-vises antistoffbiblioteker bli en kraftig alternativ teknologi som kan tilby unike fordeler og suksess der konvensjonelle teknologier kan møte begrensninger 1, 2.
I lys av den betydelige behov for kvalitets antistoffer som forskningsverktøy, to primære utfordringer for å generere fornybar antistoffer er 1) utvalg gjennomstrømming og 2) antigen availability. Et antall grupper har nå beskrives in vitro seleksjons rørledninger med sikte på å øke gjennomstrømningen og frekvensen av antistoff identifikasjon. Disse beskrivelsene detalj en rekke levedyktige tilnærminger som inkluderer valg på enten full-lengde er rettet mot 3,4, eller strukturelt relaterte domener 5,6,7, enten ved hjelp perle baserte 6,8 eller plate-baserte 3,4 antigen immobilisering ordninger. I tillegg har den økende bruk av gen-syntese teknologier 9 gjort systematisk antigen generasjon, spesielt av isolerte domener, rimelig kostnadseffektivt og kan potensielt eliminere problemer med å skaffe tilstrekkelige mengder av renset, full-lengde antigen. Ved å bruke de to teknologiene i tandem, ble en selvstendig og skalerbar antigen generasjon og antistoff utvalg rørledning utviklet som ville gjøre det mulig parallell isolering av antistoffer for store sett med uttrykt antigen domener og legge til rette for utvikling av reagenser for characterizing hele klasser av strukturelt eller funksjonelt relaterte proteiner.
Mot dette målet, en integrert rørledning som par i silico identifikasjon av uttrykk antigen domener, gen syntese, høy gjennomstrømming bakteriell uttrykk for antigener og skalerbare fag-vises antistoff valg har blitt utviklet. Denne rørledningen krever bare grunnleggende infrastruktur tilgjengelig for de fleste life science laboratorier (herunder antistoffbiblioteker som er stadig mer tilgjengelig gjennom lisens eller materialoverføringsavtalen), men er også mottagelig for automatisering for bruk i industriell skala. Ved bruk av denne protokollen, er det mulig å generere hundrevis av affinitet-merket antigen domener, og rutinemessig isolerer høyspesifikke antistoff-fragmenter til mange av disse antigenene.
Phage display teknologi har vist demonstrert kompatibilitet med en rekke forskjellige rekombinante affinitetsreagens formater, inkludert Fab, scFv, Fv og autonome domener og envoksende utvalg av små "alternative rammeverk" (designet ankyrin gjenta proteiner (DARPINS), fibronektin (FN), lipokalin domener og mer 10). Diskusjonen er begrenset i dette eksempel til isolasjon av Fab-antistoff-fragmenter, selv om det er antatt disse metodene kan tilpasses andre typer av biblioteker. Ved hjelp av denne teknologien, Fab-fragmenter med lav nanomolar affinitet til små, merket proteindomener inkludert transkripsjonsfaktordomener, SH2-domener, RNA-bindende proteiner og andre har blitt valgt, og mange av disse binder full-lengde protein, og som er funksjonelle i immunoanalyser som immunfluorescens , immunopresipitering og immunhistokjemi. Viktigere, rekombinante bindende kloner er fullt fornybar og kan bli re-genereres fra uttrykk konstruerer via bakteriell produksjon gir økt konsistens, reproduserbarhet og kostnadseffektivitet, og dermed rettferdiggjøre bekostning av strenge klone validering.
I denne protocol og tilhørende video, er grunnleggende metoder for antistoff utvalg fra fag-vises biblioteker bruker immobilisert antigen domener demonstrert. Denne metoden benytter GST-merket proteindomener immobilisert ved passiv absorpsjon i mikroplater, selv om andre koder 11,12,13 og utvelgelses formater 13,14,2 har også vært brukt med hell. Kritiske betraktninger for oppsett og gjennomføring av valg med parallell overvåking av valgparametere som tar sikte på å identifisere og isolere spesielt beriket klonale antistoffer for validering er detaljert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når du driver in vitro antistoff valg, de to viktigste faktorer som bestemmer valg suksess er 1) isolering av godt foldet antigene mål for valg på og 2) tilgjengeligheten av en høy funksjonell mangfold antistoff bibliotek. I mange tilfeller kan tilgjengeligheten av tilstrekkelige mengder av godt foldet, full-lengde protein være begrensende. En tilnærming for å overvinne denne begrensningen er å bruke domener identifisert fra bioinformatiske analyse 22 og syntetisert for innsetting i en bakter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke NIH felles fond – Protein oppbringelsesreagensene Program for å finansiere utviklingen av rekombinant antistoff Network antistoff utvalg og karakterisering rørledning og den kanadiske Foundation for innovasjon for finansiering kjøp av robot utvalg plattformen.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
