Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное
Summary
Микрофлюидных струйное против интерфейса капли липидного бислоя обеспечивает надежный способ генерировать пузырьки с контролем над мембраной асимметрии, включения трансмембранных белков, и инкапсуляции материала. Этот метод может быть применен для исследования различных биологических системах, где узконаправленных биомолекулы желательно.
Abstract
Снизу вверх синтетическая биология представляет собой новый подход к расследованию и воссоздания биохимические системы и, возможно, минимальные организмы. Это новая область участвует инженеров, химиков, биологов, и физиков в разработке и сборке основных биологических компонентов в сложных функционирующих систем снизу вверх. Такие системы снизу вверх может привести к развитию искусственных клеток для фундаментальных биологических запросов и инновационных методов лечения 1,2. Гигантские однослойные везикулы (GUVs) может служить в качестве платформы для модели синтетической биологии из-за их клеток-подобную структуру мембраны и размера. Микрофлюидных струйное или microjetting, является метод, который позволяет для генерации GUVs с контролируемым размером, состава мембраны, трансмембранный белок включения, и инкапсуляции 3. Основной принцип этого метода является использование нескольких, бобовых высокочастотных жидкости, порожденных пьезо-приводом струйный устройства для деформации условный лIPID двухслойная в GUV. Процесс сродни дует мыльные пузыри от мыльной пленке. Изменяя состав летают решения, состава, охватывающего решения, и / или компонентов, включенных в бислой, исследователи могут применять эту методику для создания пользовательских пузырьки. Эта статья описывает процедуру для создания простых пузырьки из интерфейса капли бислоя на microjetting.
Introduction
Она становится все более ясно, что клеточная биология является многопрофильным масштаб проблемы, что предполагает интеграцию наше понимание от молекул к клеткам. Следовательно, зная точно, как молекулы работать индивидуально не достаточно, чтобы понять сложные клеточные поведения. Отчасти это связано с существованием возникающих поведения многокомпонентных систем, о чем свидетельствует воссоздания актина сетевого взаимодействия с липидный бислой пузырьков 4, митотической сборки шпинделя в Xenopus извлечь 5, и пространственная динамика бактериальных деления клеток механизмов 6. Один из способов, чтобы дополнить подход редукционистской в рассекает молекулярные процессы живых систем является взять противоположный подход о возвращении к сотовой поведения с использованием минимального набора биологических компонентов. Важной частью этого подхода предполагает надежную герметизацию биомолекул в ограниченном объеме, ключевую функцию клетки.
e_content "> Несколько стратегии существуют для инкапсуляции биомолекул для изучения биомиметических систем. Наиболее биологически значимым система липидные двухслойные мембраны, которые имитируют биохимических и физических ограничений, налагаемых мембране клетки плазмы. Формирование гигантских однослойные пузырьки (GUVs) по electroformation 7, один из наиболее широко используемых методов для генерации GUV 14, как правило, имеет плохой урожай инкапсуляции из-за его несовместимости с высоким содержанием соли буфера 8. Electroformation также требует больших объемов выборки (> 100 мкл), которые могли бы быть проблемой для работы с очищенных белков , и неэффективно включает большие молекулы из-за сложности диффузии между близко расположенными слоями липидов. Несколько микрофлюидных подходы к генерации липидные пузырьки были разработаны. двойной методы эмульсии, которые проходят компонентов через два интерфейса между слоями воды-масло-вода (W / O / W), зависит от испарения VOlatile растворителя ездить липидный образование двухслойную 9. Другие использовали микрофлюидных конвейера, который производит непрерывный поток липидного бислоя везикулы 10 или на два этапа: 11. Мы разработали альтернативный метод, основанный на быстро подаче импульсов жидкости против интерфейса капель бислой 12 для получения GUVs контролируемого размера, состава и инкапсуляции. Наш подход, известный как микрофлюидный струей, предлагает сочетает в себе преимущества из нескольких существующих методов генерации пузырьков, обеспечивая подход для создания функциональных биомолекулярные системы для исследования различных биологических проблем.Protocol
Representative Results
Discussion
Многие методы были разработаны для генерации пузырьков, в том числе electroformation, эмульсии, капли и генерации 14-16. Тем не менее, новые экспериментальные методы необходимо учитывать при проектировании биологических систем с растущей сходство с живыми системами. Микрофлюидных методы ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Майк Vahey от Флетчера Lab при Университете Калифорнии, Беркли за советом о параметрах microjetting. Эта работа была организована NIH грант DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
