小鼠异位心脏移植技术

Summary

这份手稿描述了在小鼠进行异位心脏移植手术所需的步骤。

Abstract

现在是四十多年来，因为这种技术最早由科里，永利和罗素。虽然花了一些年，其他实验室成为精通并利用该技术，目前已广泛应用于世界各地的许多实验室。一个显著细化到原来的技术的开发和新实报道于2001年。这里描述的是已经在三个外科医生（Plenter，格拉齐亚，彼得拉）在我中心手中发展了十余年的技术。这些技术现在被传递到年轻一代的外科医生和研究人员。

主要基于新实经验，所使用的程序已经进化中的细节 – 细节，我们将尽力这里涉及这样一种方式，其他人可能能够使用这个非常有用的模型。像新实，我们已经发现，视频辅助学习是初学者一个无价的资源。

Introduction

当它可以在小鼠进行肾，肺，肝脏和胰腺移植的时代，基本的器官移植和免疫学研究自1973年以来的基石^1-4保持在鼠标异位心脏移植模型。在随后的几年一些论文已经发表，详细改进/优化^5,6到这个程序。

随着实体器官主要血管移植模型这个程序是首屈一指的。一旦掌握了这种方法适合于研究分为异体排斥反应^7，慢性血管病变⁸和缺血再灌注损伤⁹机制的发展。

成功地学习这个过程的关键是，就像任何其他手术，耐心的教练和学员，注重细节的部分。在该过程开始时，新的外科医生会发现吨哎会花很多时间在每个移植。随着经验的不断积累，手术时间，因此缺血，会大大减少。注重每一个步骤的详细迟早会走向成功。

而教师可以尽自己所能传递，并预测，所有可能在这些手术可能遇到的可能坑瀑布，“创意”实习生将有可能找到一些自己的！

是程序的基本过程如下：捐助升主动脉弓端 – 侧吻合到受体腹主动脉与供体肺动脉端 – 侧吻合到受体腹下腔静脉（IVC）。从逆行时尚收件人主动脉通过捐助主动脉冠状动脉血流量。一旦血已通过冠状系统它漏入右心房通过冠状窦流出，被泵入右心室和然后通过肺动脉进入收件人IVC。以这种方式，冠状动脉系统供给的动脉血和窦性心律返回到接枝内灌注1-2分钟。由于心脏的左厢房正在加载基本上压左室游离壁就会萎缩随着时间的推移。

Protocol

所有动物饲养的无病原体条件下，在根据IACUC批准科罗拉多巴巴拉戴维斯中心动物设施大学和照顾根据美国国立卫生研究院指南。 麻醉深度是由脚趾捏最初并遵守呼吸速率判断，一旦程序已经开始。 1，供心收获注射戊巴比妥（60毫克/公斤的IP）麻醉供体小鼠。 通过4路限制固定鼠标和剪辑皮毛。用酒精擦拭皮肤。 解剖远离皮肤上后，通过使横切口正好逊色于膜片打开腹腔。 切开膈肌后到沿海插入和解除前胸壁前上方暴露心脏。 延伸的完整厚度切开后外侧胸腔在胸部的左侧和右侧。 隔离下腔静脉（IVC）和周围放置IVC松散5-0丝线缝合邻近其插入到右心房。 注入1.0毫升4℃肝素生理盐水（200 U /立方厘米）到下腔静脉，然后结扎血管用5-0丝线缝合和鸿沟。 隔离右上腔静脉（rSVC）以类似的方式，并结扎用5-0丝线缝合和鸿沟。 轻轻摇动心脏对动物的右侧和隔离左上腔静脉（lSVC），结扎用5-0丝线缝合，分化露出左肺动脉。 下湿纱布保护心脏，而胸腺钝解剖远离主肺动脉（PA）和左，右PA分支机构及升主动脉弓。 钝性解剖主动脉弓游离周围组织的。微型剪刀是用来划分主动脉近端右肱动脉头侧， 即应该有心脏和部门之间没有分支点的主动脉。 本节中的主动脉弓形成动脉压脉袋的植入过程。 反映主动脉袖口inferiorly，露出树干的PA和PA的左，右分支。 钝解剖左和右PA分支离周围组织从心脏尽可能远。这允许从周围组织中的PA的躯干的容易清扫。 划分PA作为主干远端越好，刚好接近其分叉。本节中的肺动脉的形成静脉压脉袋的植入过程。 广场周围的心脏和领带的基础5-0丝线缝合。的心脏，然后切成免费在该基地，并置于4℃生理盐水。总收获时间是约。 10-15分钟。 2，心脏植入技术麻醉受体小鼠用戊巴比妥（60毫克/公斤的IP的起始剂量，如需要25毫克/公斤的IP补充剂量）。 剪辑的皮毛和通过4路限制固定鼠标和预习用聚维酮碘和悬垂在一个无菌的方式在皮肤上。 做2厘米的垂直中线腹部切口，进入腹腔。 收回肠优和外在的胸部。请将包裹在无菌湿纱布（无菌生理盐水）整个情况。 下面孤立肾血管腹主动脉和下腔静脉（IVC），并放置主动脉周围4-0棉关系，下腔静脉，然后优越劣于吻合部位。 找出任何腰椎血管内场和结扎与10-0尼龙线。 结棉关系，首先劣质其次是优越的。在这样一些血液被保持在使织脉切开术容易主动脉。 用30号针头形成织脉切开术进入主动脉的管腔。延长切口用细显微剪到大约2毫米的长度。此切口在沿长直线该船只的itudinal轴。 做一个结束捐助主动脉在以下时尚收件人主动脉端侧吻合。放置一个10-0尼龙线缝住在供体主动脉和切口在收件人主动脉和领带的下角。将第二个10-0尼龙对面先在供体和主动脉切口在腹主动脉和领带的优越角落。 使正在运行的缝合线从优去劣于主动脉侧壁和领带对先前放置的住宿针。一定要带的intimas（容器内表面）一起为你缝合。然后缝合在一个正在运行的时装和领带内侧。每一侧的第一个和最后缝应尽可能靠近逗留针越好。然后目标是有3均匀间隔即总共5针这两者之间的针迹。 做一个结束捐助肺动脉收件人IVC以下时尚侧吻合。 PunctURE下腔静脉用30号针头，并延长切口约。 2mm的细显微剪。此切口在沿容器的纵向轴线成一直线。 领带的捐助肺动脉切口的下腔静脉的下角落10-0尼龙。将第二个10-0尼龙对面的第一供体动脉和切口下腔静脉和领带的优越角落。 使肺小动脉及下腔静脉和领带之间的连续缝合线。每一侧的第一个和最后缝应尽可能靠近逗留针越好。然后的目标是有5个均匀分布的制作共7针两针之间。 松开远端4-0棉领带重新建立静脉血流。 一旦静脉吻合术的止血已经观察到近端4-0棉布领带逐渐松动和动脉吻合观察止血。当两个吻合口被认为是安全的，删除C奥多栓从鼠标。 返回肠道腹部。腹壁封闭在用5-0丝线缝合在运行方式两层。 管理一个1.0毫升的静脉团无菌，温暖的生理盐水到腹部为收盘时液体复苏和0.8 ml生理盐水皮下注射手术后。手术时，不需要任何其他支援措施。恢复动物的升温毯。共植入时间约为90-120分钟，适合初学者，45-60分钟，使用经验。管理丁丙诺啡镇痛，0.05毫克/千克，资深大律师，0.1-0.2毫升在程序的开始，每6-12小时72小时后运。 3，嫁接评估每天通过经腹部触诊评估肾功能。 按住鼠标，就好像是被给予腹腔注射。 轻轻地压在腹壁食指的前端，并确定打浆STRength的移植性和规律性。 给触诊质量从4的分数（正常幅度和频率）设​​置为0（非打浆拒绝接枝）。 重要注意事项： 所有仪器进行灭菌，无菌手套戴在整个过程和无菌区被保持。供体和受体手术是通过使用在手术显微镜进行。确保吻合是“干净”。即，将针时背面壁没有被捕获。这将导致一个显著收缩流动在一个失败的移植物，在极端情况下，这将很可能导致以后肢瘫痪。这也是非常重要的，全厚度通过包括血管外膜和缝合针的内膜得以实现。边缘的Evertion也确保有内膜至中膜接触，这有助于密封和吻合口愈合。另一个非常重要的事实或者是，确保在吻合缝合线的张力也是最优的。太松，就会出现不可逆的泄漏，过紧和狭窄流动将导致。如果动脉侧，这将导致移植物灌注不良，如果在静脉侧拥挤心脏将导致。

Representative Results

这种手术技术的使用率无论是简单的移植物的存活/排斥反应的研究，还是蛮复杂的实验方案开辟了道路。在下面的图中简要介绍了研究中，我们力图确定的参与，如果有的话，Fas和/或穿孔为CD4 + T细胞介导的​​心脏排斥反应机制。这之所以成为可能，通过小鼠品系目前可用的非凡的数组。结果表明，直接抑制心脏移植的CD4效应T细胞的需要接枝Fas表达和T细胞穿孔素表达的替代性的贡献。据我们所知，这是首次证明了由CD4 + T细胞杀伤活性可以玩初级急性排斥反应在体内的专性作用。 1.JPG“/> 图1穿孔素和Fas专性代表和CD4 + T细胞介导的心肌抑制维生素B6，B6 PFPKO（穿孔素基因敲除），和B6 GLD 平行路径 （FAS配体不足）的CD4 T细胞被用来重建B6 抹布- / -收件人C3H野生型或FAS缺陷C3H LPR心脏移植。去除的Fas单独的（♦，P = NS与控制体重的C3H + B6的CD4 + T细胞）从供体心脏或罢免或穿孔单纯从CD4 + T细胞（■，P = NS与控制体重的C3H + B6的CD4 + T细胞）没有废除排斥。有趣的是，从效应子CD4 + T细胞的FasL蛋白去除的那样延迟排斥显著（●，P <0.02与重量C3H + B6的CD4 + T细胞，P <0.01相对于体重的C3H + B6 PFPKO CD4 + T细胞，和P <0.01，与。C3H LPR + B6的CD4 + T细胞）。然而，大多数移植仍然拒绝（4）。显著，同时去除捐助国Fas和CD4 + T细胞穿孔素完全消除排斥反应（○，P <0.002相对于对照重量C3H + B6的CD4 + T细胞，重量C3H + B6 PFPKO CD4 + T细胞，和C3H 的lpr + B6的CD4 + T细胞）。这废止是显著比单独去除CD4 + T细胞FasL的更强大（○，P <0.003与控制体重的C3H + B6 GLD CD4 + T细胞）。从格拉齐亚等[10]。经许可后转载。

Discussion

这种手术方法是不容易掌握，但一旦掌握是一个强有力的研究工具。研究者/外科医生是由技术的一致性和通过注重细节的回报。在学习阶段耐心是关键。正如新实3发布，与一个基于视频的学习工具花费平均为11努力实现第一次成功的过程和78企图达到90％的成功率的帮助。视频已成为一个重要的教学工具在手术^11,12。

故障排除

从吻合口出血，可能会发生，这可能是由于要么缺乏正确的张力的缝合线，或太少缝合。虽然凝血诱导剂，如明胶海绵可减少泄漏非常有用，我们建议医生应该依靠良好的技术。拥挤的非跳动的心脏是最常见的原因为吻合口太紧，特别是在静脉侧。非BEATI纳克，非灌注移植物通常是由一个空气泡已行进到冠状动脉中的一个引起的。它保持了潮湿对湿字段以避免气泡进入血管是非常重要的。

该技术的局限性

这种技术是不适合，如果一个研究者想研究一个全面运作的心脏效应。这就需要原位移植术，迄今已证明不可能执行。

相对于现有方法的意义

如果要研究对小鼠完全血管化，实体器官移植的效果，那么心脏模型可能是最简单的掌握。肺，肾和肝移植的小鼠模型确实存在，但更难学习和完善。

关键步骤在议定书内

这是非常重要的全厚度P驴包括血管外膜和缝合针的内膜得以实现。边缘的Evertion也确保有内膜至中膜接触，这有助于密封和吻合口愈合。另一个非常重要的因素是确保吻合缝合线的张力也是最优的。太松，就会出现不可逆的泄漏，过紧和狭窄流动将导致。如果动脉侧，这将导致移植物灌注不良，如果在静脉侧拥挤心脏将导致。

总之，重复，程序和持续注重细节的一致性，将产生很大的成绩，可资助和发布的数据。

Materials

Instrument	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Straight micro-dissecting forcep #5	RS-5015	11295-51
Curved micro-dissecting forcep #7	RS-5047	11297-00
Curved serrated forcep	RS-5137	11052-10
Vannas micro-dissecting scissors, short	RS-5610		09.140.08
Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long			11.602.11
Micro spring handle needle holder			11.549.15
Straight mosquito forcep		91308-12
Micro-dissecting scissors, straight, blunt	RS-5962	14078-10
Micro-dissecting scissors, curved, blunt	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
Silk suture, 5/0, 22.5m spool		18020-50
Suture
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 silk			E19A05N
Gloves		Drapes
Biogel from Medex Supply		Precept, #64-9012-9
Syringes		Cotton applicators
B-D 1cc insulin, #329424		Fisher-brand, #23-400-100
Povidone-Iodine swabs
PDI, #B40600
4/0 Cotton ties
Domestic cotton autoclaved with instruments