Summary

子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

Published: May 23, 2014
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Summary

子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞培養系を確立することは、貴重な生物学的な手法と先行研究の目的の広大な配列を追求する重要なステップである。ここでは、ヒト患者の外科的に切除された子宮内膜組織からの間質培養物を確立するために使用される2つの方法を記載する。

Abstract

多くの努力が、インビトロ細胞培養系確立するために専念している。これらのシステムは、in vivoでの膨大な数のプロセスをモデル化するように設計されている。人間の子宮内膜のサンプルから生じる細胞培養システムも例外ではありません。アプリケーションでは、通常のサイクリックな生理的プロセスからこのような婦人科癌、感染症、生殖不備などの子宮内膜の病変の範囲です。ここでは、外科的に切除、子宮内膜子宮摘出標本からの一次子宮内膜間質細胞を確立するための2つの方法を提供する。第一の方法は、「削り法」と呼ばれ、第2の方法と呼ばれるのに対して、外科的または剃刀の刃を用いて機械的掻き取りを組み込んで、「トリプシン法」この後者の方法は、細胞の分離および原発を促進するために、トリプシンの酵素活性を使用し細胞伸長。私たちは、デジタル画像や顕微鏡を通してステップバイステップの方法論を示している。我々はまた、提供します:定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(定量PCR)及び免疫蛍光(IF)を介して、子宮内膜間質細胞株を検証するための電子例。

Introduction

ヒト子宮コーパス3層、子宮外膜(又は漿膜)、子宮筋層及び子宮内膜から構成されている。これらの層のそれぞれを区別することは、子宮内膜細胞株を確立するための重要なステップである。子宮外膜は子宮の最も外側の層であり、薄い、漿液細胞からなる。子宮筋層の厚さの中間層であり、平滑筋細胞からなる。子宮内膜は、子宮の内層として同定され、上皮および間質細胞集団を含む。

子宮内膜は、さらに、その幹細胞集団は、約28日ごとに1 functionalis層を再増殖すると仮定されている基底層に細分される。ヒト子宮内膜のfunctionalis層は、ホルモンの循環に応じて、重要な生化学的および形態学的変化を受ける。これらのホルモンは、下垂体や卵巣から派生しています。

ザ·コー​​ディネートの生産と生殖周期におけるホルモンの結果のリリース。生殖周期は、潜在的な胚着床イベントの子宮内膜を作製するように設計されている。ヒトでは、生殖周期」は、月経周期」として知られており、3つの段階に分け – 増殖、分泌、および月経。分泌期がfunctionalis成熟によってマークされているのに対し、増殖期はfunctionalis子宮内膜層の増殖を伴う。具体的には、細胞外の変化、分泌物、および細胞分化は、潜在的な注入を知らせる。注入は分泌期の終了前に発生しない場合は、functionalis子宮内膜層は月経期の間に流されている。月経とfunctionalis層の脱落をトリガーするイベントの重要性はまだ議論されています。ヒトでは、月経が知られている特定の中間分泌期の分化事象の結果であると提起されている「自発的脱落膜化」2など。本稿では、両方の子宮内膜間質細胞の単離方法の詳細な方法論を提供し、これらのアプローチの有効性を実証するために、免疫蛍光、デジタル画像の組み合わせを使用する。加えて、我々は一般的に適用される子宮内膜間質細胞の単離を確認するために、自発的な脱落膜化のインビトロモデルにおいて使用される。

Protocol

本稿で使用し子宮摘出標本は、IRB – HSR#14424の番号が大学のIRB承認された倫理プロトコルの一致に集めた。 臨床ソースから1。サンプル取得開始前に政府と制度に基づく倫理指針と承認の文書を入手します。 無菌状態のすべての手順を実施しています。 サンプルはすぐに培養中に処理できない場合は、4℃で50ミリリットルチューブにメディア(RPMI?…

Representative Results

プロトコルセクションで強調したように、ヒト組織を処理し、準備する際にすべての政府の下での方法、制度的、および倫理指針を実施するようにしてください。 この原稿に含まれる一次子宮内膜培養物を確立するために使用される「スクレイピング方法」の一般的なワークフロー( 図1A)および「トリプシン法」( 図1B)を示す?…

Discussion

他のグループについておよびコラゲナーゼ4,12,13,15-18を利用するほとんどが子宮内膜間質培養物を調製するための方法を適応している。本稿では、我々は経済的な理由とトリプシンの便利な利用可能性および/またはカミソリの刃のために私たちの研究室で利用され、どちらも2単純化された主要な子宮内膜間質培養法のための方法論と証拠を提供した。

我々の2つ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は彼らのイメージング顕微鏡設備の使用のために博士タオダンと彼女の研究室のメンバーの共同の努力に感謝します。我々はまた、子宮組織を私たちに提供するためのバイオレポジトリーおよび組織研究施設(BTRF)コア、ジェフ·ハーパー、バージニア大学の住民に感謝。私たちは、回路図の概要のヘルプはカロルSzlachtaに感謝します。

Materials

0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin  Hyclone  SH3023602 or SH30004202  
1.7 micro Centrifuge Tube   Genesee Scientific  22-272A 
1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette   Genesee Scientific  24-401,24-402, 24-412, 24-430 
15ml Conical Tube  Hyclone  339650
50ml Conical Tube  Hyclone  339652
6cm Cell Culture Dish  Thermo scientific   12-556-002 
8 well Chambers  Thermo Scientific  AB-4162 
Acetate  Fisher scientific  C4-100 
AMV RT Enzyme/Buffer  Bio Labs  M077L 
Bovine Serum Albumin (BSA)  Fisher Scientific  BP-1605-100 
Buffered Zinc Formalin  Thermo  59201ZF 
Charcoal strip FBS  Fisher  NC9019735  
Chloroform  Fisher Scientific  BP1145-1
Cover slip  Fisher Brand   12-544D 
Cyclic AMP (cAMP)  Sigma  B7880
DMEM/High Glucose  Hyclone  SH30243FS 
dNTP  Bioline  BIO-39025 
Donkey Anti Goat -TRITC  Santa Cruz  SC-3855 
Donkey Serum  Jackson’s lab   017-000-002 
E Cadherin Antibody   Epitomics  1702-1
Ethanol  Fisher Scientific   BP2818-1
Fetal Bovine Serum (FBS)  Fisher Scientific 03-600-511 
Fungizone Amphotericin B  Gibco  15290-018 
GAPDH Probe  Life Technologies  HS99999905 
Glycogen  5Prime  2301440
Goat Anti Mouse -FITC  Jackson’s Lab  115-096-003 
Isopropanol  Fisher Scientific  BP2618-1
Kanamycin   Fisher Scientific  BP906-5 
Medroxyprogesterone acetate (MPA)  Sigma  M1629
MeOH (Methanol)  Fisher Scientific  A4-08-1 
Mounting Media (w/DAPI)  Vector Labratories  H-1500 
N6 DNA Oligos  Invitrogen 
Number 15 Scraper   BD  371615
Pan Cytokeratin  Mouse mAB  Cell Signaling   4545
PBS (phosphate buffered saline)  Fisher Scientific  BP-399-4 
Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X   Hyclone   SV30082.01 
PML Anti Goat Anti body  Santa Cruz  SC-9862 
Primer(s)  Eurofins 
RPMI  Hyclone   SH30027FS 
RPMI (Phenol free)  Gibco  11835
Sybr Green   Thermo Scientific  AB-4162 
Taqman  Thermo  AB-4138
Trizol  Life Technologies  15596018
Vimentin Antibody  Epitomics  4211-1

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Cite This Article
Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens. J. Vis. Exp. (87), e51513, doi:10.3791/51513 (2014).

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