Dois métodos para estabelecer células endometriais Humano estromais primários de espécimes de histerectomia
Summary
Estabelecimento de sistemas de cultura primária de células do estroma endometrial a partir de espécimes de histerectomia é uma técnica biológica valioso e um passo crucial antes de prosseguir uma vasta gama de pesquisa objetiva. Aqui, descrevemos dois métodos utilizados para estabelecer culturas de tecidos do estroma endometriais ressecados cirurgicamente de pacientes humanos.
Abstract
Muitos esforços têm sido dedicados a estabelecer em sistemas de cultura de células in vitro. Estes sistemas são concebidos para modelar um vasto número de processos in vivo. Sistemas de cultura de células resultantes de amostras endometriais humanos não são excepção. As aplicações vão desde processos fisiológicos normais cíclicos de patologias endometriais, tais como cancros ginecológicos, doenças infecciosas, e deficiências na função reprodutora. Aqui, oferecemos dois métodos para o estabelecimento de células estromais endometriais primários de espécimes ressecados cirurgicamente histerectomia endometriais. O primeiro método é referido como "o método de raspagem" e incorpora raspagem mecânica usando lâminas cirúrgicas ou de barbear ao passo que o segundo método é denominado "o método de tripsina." Este último método utiliza a actividade enzimática da tripsina para promover a separação de células e primário conseqüência celular. Nós ilustramos metodologia passo-a-passo através de imagens digitais e microscopia. Nós também provide exemplos para validar as linhas de células estromais do endométrio através de tempo real, as reacções em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e imunofluorescência (IF).
Introduction
O corpo do útero humano é composto por três camadas, a perimétrio (ou serosa), miométrio e endométrio. Distinguindo cada uma destas camadas é um passo importante para estabelecer linhas de células do endométrio. O perimétrio é a camada mais exterior do útero e do composto, as células serosas finas. O miométrio é a espessura da camada, meio do útero e composta por células de músculo liso. O endométrio é identificada como a camada interna do útero e inclui populações epiteliais e células estromais.
O endométrio é subdividida na camada basal, cuja população de células-tronco é a hipótese de repovoar a camada functionalis aproximadamente a cada 28 dias 1. A camada functionalis do endométrio humano é submetido a alterações bioquímicas e morfológicas significativas na resposta a hormonas circulantes. Estas hormonas são derivados a partir da glândula pituitária e os ovários.
Oprodução coordenada e liberação de hormônios resulta em um ciclo reprodutivo. O ciclo reprodutivo é projetado para preparar o endométrio para potenciais eventos de implantação do embrião. Nos seres humanos, o ciclo de reprodução é conhecido como "ciclo menstrual" e divide-se em três fases – proliferativa, secretora, e menstruais. A fase proliferativa envolve a proliferação do endométrio functionalis camada enquanto que a fase de secreção está marcada por functionalis maturação. Especificamente, as alterações extracelulares, secreções e diferenciação celular sinalizar uma implantação potencial. Se o implante não ocorrer antes do final da fase de secreção, a camada functionalis endométrio é eliminado durante a fase menstrual. A importância da menstruação e os eventos que provocam o desprendimento da camada functionalis ainda estão sendo debatidas. Nos seres humanos, tem-se colocado que a menstruação é o resultado de um evento específico mid-secretora diferenciação fase conhecidacomo "decidualização espontânea" 2. Neste manuscrito, nós fornecemos metodologia detalhada para ambos os métodos de isolamento de células do estroma endometrial, e usar uma combinação de imunofluorescência e imagens digitais para demonstrar a eficácia dessas abordagens. Além disso, foi aplicado um comumente utilizado em modelo in vitro de decidualização espontânea para confirmar o isolamento de células do estroma endometrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Outros grupos descritos e adaptado metodologia para a preparação de culturas do estroma do endométrio, a maioria dos quais utilizam colagenase 4,12,13,15-18. Neste manuscrito, nós fornecemos metodologia e evidências para dois métodos de cultura de estroma endometriais simplificados primários, os quais são utilizados por nosso laboratório por razões económicas ea disponibilidade conveniente de tripsina e / ou uma lâmina de barbear.
Ao comparar os nossos dois métodos, a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os esforços de colaboração do Dr. Dang Thao e membros de seu laboratório para o uso de seus equipamentos de imagem e microscópio. Agradecemos também a biorepository e Tissue Research Facility (BTRF) núcleo, Jeff Harper, e os moradores da Universidade de Virginia por nos fornecer o tecido uterino. Agradecemos Karol Szlachta pela ajuda com esquemática Overview.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
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