Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
Um dos desafios em curso em engenharia de tecido neural é a criação de um canal do nervo (NC) que imita a matriz extracelular, onde os nervos crescem naturalmente. A pesquisa mostrou que as células respondem a vários fatores em seu ambiente, incluindo mecânica, topográfica, adesivo e sinais químicos 1-3. Um dos principais desafios nesta área é determinar a combinação adequada de sinais e fabricação de um sistema que pode manter pistas por um longo período para apoiar o crescimento de células 4. Neurónios periféricos são conhecidos a preferir um substrato macio, ser dirigido por fibras alinhadas, e responder ao factor de crescimento do nervo (NGF) 5-7. CNs que pode fornecer pistas químicas durante semanas têm sido mostrados para proporcionar uma melhor recuperação funcional mais próximo ao de enxertos, o padrão ouro atual para o reparo do nervo 8,9.
Materiais e métodos de produção Vários pode ser usado para produzir mecânica e topográficoal deixas 10-13. Sinais mecânicos são inerentes ao material escolhido, fazendo com que a seleção do material apropriado para a aplicação crítica 1,13. Os métodos de produção para controlar sinais topográficos incluem a separação das fases, a auto-montagem e eletrofiação 1,13. Para aplicações em microescala, microfluídica, photopatterning, gravar, lixívias sal, ou espumas de gás também pode ser usado 14-17. Electrospinning surgiu como a forma mais popular para engenheiro substratos fibrosos para cultura de tecidos, devido à sua flexibilidade e facilidade de produção 13,18-23. Nanofibras electrospun são fabricados pela aplicação de uma alta tensão de uma solução de polímero fazendo-a afastar-se e estender-se através de um curto intervalo de descarga 24. Um andaime alinhado pode ser criado através da recolha das fibras num mandril rotativo ligado à terra e não alinhados andaimes são recolhidos numa placa fixa 25. Adesão de sinalização pode ser conseguida através do revestimento do engenho andaime fibrosoh fibronectina ou conjugação de um péptido de aderência, tal como RGD, para o HA antes electrospinning 26.
Sinais químicos, tais como fatores de crescimento, são as mais difíceis de manter por longos períodos, porque eles precisam de uma fonte de liberação controlada. Muitos sistemas foram tentou adicionar liberação controlada de redes fibrosas electrospun com níveis variados de sucesso. Estes métodos incluem electrospinning mistura, emulsão electrospinning, shell electrospinning núcleo e conjugação de proteínas 27. Além disso, electrospinning é tradicionalmente realizada num solvente volátil, o que pode afectar a viabilidade da proteína de 28, mantendo assim a bioactividade da proteína deve ser considerada.
Esta abordagem trata especificamente combinando, sinais químicos e adesivos mecânicos, topográficos para criar um andaime ajustável para o crescimento do nervo periférico. Mecânica de andaime é precisamente controlada pela sínteseÁcido Hialurônico metacrilado (HA). Os locais metacrila��o são usados para anexar fotos crosslinkers reativos. O material reticulado não é solúvel em água e é exclusivamente discriminado por enzimas 29. A quantidade de reticulação altera a taxa de degradação, mecânica e outras propriedades físicas do material. Usando HA com 30% metacrila��o, que tem um módulo de elasticidade de aproximadamente 500 Pa, cria um substrato macio que está perto das mecânica nativas de tecido neural e é tipicamente preferido pelos neurónios 26,29. Electrospinning sobre um mandril rotativo é usado para criar fibras alinhadas para um taco topográfico. Usando electrospinning juntamente com microesferas fornece sinais químicos no interior da armação ao longo de períodos prolongados. Para suportar o crescimento de neurites microesferas contendo NGF são utilizadas para criar o sinal químico. Ao contrário da maioria materiais electrospun HA é solúvel em água de modo que o NGF não encontrar solventes agressivos durante a produção. Para adicionar um sinal de adesivo, o scaffold é revestido com fibronectina. O sistema completo contém todos os quatro tipos de sinais acima descritos: fibras macias (mecânicos) alinhadas (topográficas) com NGF libertando microesferas (química) revestidos com fibronectina (adesivo). Produção e ensaio do presente sistema é descrito neste protocolo.
O processo começa com a produção de microesferas com um água-em-óleo-em-água de emulsão dupla. A emulsão é estabilizada com um agente tensioactivo, álcool polivinílico (PVA). A fase aquosa interna contém a proteína. Como é adicionada à fase de óleo, contendo o material de revestimento de PLGA dissolvido em diclorometano (DCM), o agente tensioactivo cria uma barreira entre as fases que protegem a proteína a partir de DCM. Esta emulsão é de outra fase dispersos em água contendo PVA para criar a superfície externa das microesferas. A emulsão estável é agitada para permitir que o DCM evapore. Depois de enxaguar e liofilização você é deixado com a microesferas cont secoaining a proteína.
Após as microesferas são concluídas eles estão prontos para ser electrospun em andaimes. Primeiro você preparar a solução electrospinning. A viscosidade da solução é crítico para a formação de fibras adequado. Soluções de puro HA não atender a esse requisito; PEO é adicionado como um polímero de suporte para permitir electrospinning. As microesferas são adicionadas à solução e electrospun resultando num andaime fibroso com microesferas distribuídas por toda parte.
Uma vez que a produção é completa, a proteína deve ser testada para verificar a sua viabilidade. Para fazer isso, uma célula primária que responde a NGF pode ser utilizada. Este protocolo utiliza Dorsal Root Ganglia (DRG) 8-10 dias de idade, os embriões de galinha. Os feixes de células são semeadas em scaffolds contendo microesferas cheias de NGF aqueles que estão vazios ou. Se o NGF é ainda viável você deve ver um maior crescimento neurite nas NGF contendo andaimes. Se o NGF não é mais viável que vainão promover neurites para ampliar e deverá ser semelhante ao controle.
O procedimento exacto aqui descrito é focada em suporte neural, no entanto, com modificações simples para o material, o método de electrospinning, e proteínas do sistema pode ser optimizado para vários tipos de células e tecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muitos estudos têm mostrado que as células nervosas pode ser dirigido por sinais topográficos (alinhamento de fibra) e sinais químicos (fatores de crescimento) 1,2,10,11,35. Eletrofiação é um método fácil para criar fibras alinhadas. Factores de crescimento de estimular o crescimento do nervo, mas de modo a incluir os em condutas nervosas (NC), é necessário um método para libertação sustentada. Para criar um sistema mais robusto com as duas pistas, estes dois sinais devem ser combinados. Vários…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
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