To-Photon<em> In vivo</em> Imaging av dendrittutløperne i Mouse Cortex Bruke en Tynnet-skalle Forberedelse
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
I pattedyr cortex, nevroner danner ekstremt kompliserte nettverk og utveksle informasjon ved synapser. Endringer i synaptisk styrke, samt addisjon / fjerning av synapser, forekommer i en opplevelse avhengig måte, og gir den strukturelle grunnlag av nevronal plastisitet. Som postsynaptiske komponenter av de eksitatoriske synapser i cortex, er dendrittutløperne anses å være en god proxy av synapser. Tar fordelene med mus genetikk og fluorescerende merking teknikker, enkelte nerveceller og deres synaptiske strukturer kan merkes i den intakte hjerne. Her introduserer vi en transkranial avbildning protokollen ved hjelp av to-foton laserskanning mikros å følge fluorescensmerkede postsynaptiske dendrittutløperne over tid i vivo. Denne protokoll benytter en tynnet-skallen preparat, som holder hodeskallen intakt og unngår inflammatoriske effekter forårsaket av eksponering i hjernehinnene, og cortex. Derfor kan bildene bli utført umiddelbart etter s.rgery utføres. Den eksperimentelle fremgangsmåten kan utføres gjentatte ganger over forskjellige tidsintervaller som spenner fra timer til år. Anvendelsen av dette preparatet kan også utvides til å undersøke ulike kortikale regioner og lag, så vel som andre celletyper, under fysiologiske og patologiske tilstander.
Introduction
Pattedyr cortex deltar i mange hjernefunksjoner, fra sanseinntrykk og bevegelseskontroll til abstrakt informasjonsbehandling og kognisjon. Ulike kortikale funksjoner bygger på ulike nevrale kretser, som er laget av forskjellige typer nevroner som kommuniserer og utveksler informasjon på enkelte synapser. Struktur og funksjon av synapser er konsekvent blir endret som følge av erfaringer og patologi. I den modne hjernen, tar synaptisk plastisitet form av både styrke endringer og tillegg / fjerning av synapser, som spiller en viktig rolle i dannelsen og opprettholdelsen av en funksjonell nevrale kretser. Dendrittutløperne er de postsynaptiske komponenter i de fleste eksitatoriske synapser i hjernen hos pattedyr. Den konstante omsetning og morfologiske endringer av pigger er antatt å fungere som en god indikator for endringer i synaptiske forbindelser 1-7.
To-foton laserskanning microscopy tilbyr dyp penetrasjon gjennom tykk, ugjennomsiktig forberedelser og lav fototoksisitet, noe som gjør den egnet for live bildebehandling i den intakte hjerne åtte. I kombinasjon med fluorescerende merking, gir to-foton bildebehandling et kraftig verktøy for å kikke inn den levende hjernen og følg strukturell omorganisering ved enkelte synapser med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Ulike metoder har blitt brukt til å forberede mus for live bildebehandling 9-13. Her beskriver vi en tynnet-skalle utarbeidelse av in vivo to-foton imaging å undersøke strukturelle plastisitet av postsynaptiske dendrittutløperne i muse cortex. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har våre nyere studier avbildet et dynamisk bilde av dendrittiske ryggraden endringer i respons til motoriske læring Med økende tilgjengelighet av transgene dyr med fluorescensmerkede nevronale undergrupper og rask utvikling av in vivo merking teknikker, kan lignende prosedyrer som er beskrevet her også brukes til etterforskningte andre celletyper og kortikale regioner, kombinert med andre manipulasjoner, så vel som benyttes ved sykdomsmodeller 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å få et vellykket tynnet-skallen forberedelse, flere trinn i denne protokollen er avgjørende. 1) Tykkelsen av skallen. Den kraniebenet har en sandwichkonstruksjon, med to lag av høy tetthet kompakt ben og et midtre lag av lav-densitet svampaktig ben. Mens høyhastighets mikrobore er egnet for å fjerne de ytre lag av kompakt ben og svampaktig ben, er den mikroblad ideell for tynning det indre laget av kompakt ben. Etter hvert som tykkelsen og stivheten av skallen øker under utvikling, avbildning av voksne mus t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker James Perna for den grafiske illustrasjonen. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute of Mental Health til YZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
References
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
- Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
- Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
- Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
- Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
- Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
- Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
- Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
- Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
- Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
- Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).
