Zwei-Photonen-<em> In vivo</em> Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
In der Säugetier Cortex, Neuronen äußerst kompliziert Netzwerken und den Austausch von Informationen an den Synapsen. Veränderungen in der synaptischen Stärke, sowie Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, treten in einer Erfahrung abhängig und bietet die strukturelle Grundlage der neuronalen Plastizität. Wie postsynaptischen Komponenten der Synapsen in der Großhirnrinde werden dendritische Dornen als eine gute Proxy von Synapsen sein. Unter Vorteile der Mausgenetik und fluoreszierende Markierungstechniken, einzelne Neuronen und ihre synaptischen Strukturen im intakten Gehirn gekennzeichnet werden. Hier haben wir eine transkranielle Bildgebungsprotokoll einzuführen mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zur fluoreszenzmarkierten postsynaptischen dendritischen Dornen im Laufe der Zeit in vivo zu folgen. Dieses Protokoll verwendet einen ausgedünnten Schädel Zubereitung, die den Schädel intakt hält und vermeidet inflammatorische Effekte durch die Exposition der Hirnhäute und die Rinde verursacht. Daher können Bilder sofort nach su erworben werdenrgery durchgeführt wird. Das experimentelle Verfahren kann wiederholt über verschiedene Zeitintervalle im Bereich von Stunden bis zu Jahren durchgeführt werden. Die Anwendung dieser Zubereitung kann auch erweitert werden, um verschiedenen kortikalen Regionen und Schichten sowie andere Zelltypen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, werden.
Introduction
Die Säugetier Kortex beteiligt sich an zahlreichen Hirnfunktionen, von der Sinneswahrnehmung und Bewegungssteuerung, um abstrakte Informationsverarbeitung und Kognition. Verschiedene kortikaler Funktionen bauen auf verschiedenen neuronalen Schaltkreisen, die aus verschiedenen Arten von Neuronen, die Kommunikation und den Austausch von Informationen an einzelnen Synapsen gemacht. Die Struktur und Funktion der Synapsen werden kontinuierlich in Abhängigkeit von Erfahrungen und Pathologien modifiziert. In reifen Gehirn nimmt die Form der synaptischen Plastizität beider Stärke Veränderungen und Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, spielen eine wichtige Rolle in Bildung und Aufrechterhaltung eines funktionellen neuronalen Schaltkreisen. Dendriten sind die postsynaptischen Komponenten der Mehrzahl der Synapsen im Gehirn von Säugetieren. Die Konstante Umsatz-und morphologische Veränderungen von Stacheln dienen wahrscheinlich als ein guter Indikator für Veränderungen in der synaptischen Verbindungen 1-7 dienen.
Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikropie bietet tiefe Penetration durch dicke, undurchsichtige Vorbereitungen und geringe Phototoxizität, die es für die Live-Darstellung im intakten Gehirn 8 geeignet ist. In Kombination mit Fluoreszenzmarkierung, bietet zwei-Photonen-Imaging ein leistungsfähiges Werkzeug, um in das lebende Gehirn zu spähen und folgen strukturelle Reorganisation an einzelnen Synapsen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Es wurden verschiedene Methoden verwendet, um Mäuse für Live-Imaging 9-13 vorzubereiten. Hier beschreiben wir eine dünnten Schädel Herstellung von in vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung, um die strukturelle Plastizität der postsynaptischen dendritischen Dornen in der Maus Kortex zu untersuchen. Mit diesem Ansatz haben unsere jüngsten Studien ein dynamisches Bild von dendritischen Dorn sich in Reaktion auf motorischen Lern Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Tieren mit fluoreszenzmarkierten neuronalen Teilmengen und schnelle Entwicklung der in-vivo-Markierungstechniken dargestellt, können hier beschriebenen ähnliche Verfahren auch angewendet werden, Untersuchungen zute anderen Zelltypen und kortikalen Regionen, zusammen mit anderen Behandlungen, wie auch in Krankheitsmodellen 16-23 verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um eine erfolgreiche dünnten Schädel Präparat zu erhalten, sind mehrere Schritte in diesem Protokoll entscheidend. 1) Die Dicke des Schädels. Die Schädelknochen hat eine Sandwich-Struktur mit zwei Schichten aus kompaktem Knochen mit hoher Dichte und einer Mittelschicht aus Low-Density-spongiösen Knochen. Während der Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer ist geeignet zum Entfernen der äußeren Schichten der kompakte Knochen und spongiösen Knochen, ist die mikrochirurgische Klinge ideal zum Verdünnen des inneren Schi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken James Perna für die grafische Darstellung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Mental Health, um YZ unterstützt
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
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