Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l'expression des gènes
Summary
Nous décrivons l'utilisation d'un virus de la vaccine rapporteur fluorescent qui permet la mesure en temps réel de l'infectivité virale et l'expression des gènes par le biais de l'expression spécifique au stade de fluorophores spectralement distincts rapporteurs. Nous détaillons une méthode basée plaque pour identifier avec précision l'étape à laquelle la réplication du virus est affecté en réponse à petite molécule inhibition.
Abstract
Les poxvirus sont une famille de virus à ADN à double brin qui comprennent des agents pathogènes humains actifs tels que la variole du singe, le molluscum contagiousum et Contagalo virus. La famille comprend également le virus de la variole, de la variole. En raison de la complexité de la réplication du virus de la variole, de nombreuses questions restent encore en ce qui concerne leur stratégie de l'expression des gènes. Dans cet article, on décrit la conception et l'utilisation des virus de la vaccine recombinants qui permettent de mesurer en temps réel des étapes uniques et multiples de l'expression du gène viral dans un format à haut débit. Cela est rendu possible grâce à l'utilisation de protéines fluorescentes spectralement distinctes comme reporters pour chacune des trois étapes de la réplication virale. Ces virus constituent un rapport signal-bruit tout en conservant les modes de scène spécifiques d'expression, permettant des analyses basées sur plaque et observations microscopiques de la propagation du virus et la réplication. Ces outils ont des utilisations pour la découverte d'antiviraux, les études de l'interaction virus-hôte, et bio évolutivelogie.
Introduction
Traditionnellement, l'expression de virus est étudiée en utilisant des techniques de biologie moléculaire (par exemple de transfert de Northern, Western blot, hybridation microarray, etc) 1. Bien que ces méthodes sont capables de fournir des informations détaillées en ce qui concerne la catégorisation des changements de l'expression des ARNm ou des protéines individuelles, ils ne sont généralement pas prêter à des processus en temps réel et à haut débit. Des approches alternatives à l'aide de journalistes basés sur la fluorescence ont été appliquées auparavant lorsque vous travaillez avec des poxvirus; Cependant, leur développement et leur utilisation a été motivé par des objectifs variés. Plusieurs de ces méthodes ont été conçues pour la sélection de virus recombinants 2,3. Ces techniques exprimer EGFP lors de la constitution et de l'expression de l'ADN exogène à partir de clones de la vaccine recombinants bon. De même, plusieurs souches de la vaccine exprimant de manière stable soluble ou EGFP protéines GFP-étiqueté exprimées sous un promoteur de la vaccine natif ont été largement utilisés. Ce sont typquement utilisé pour quantifier l'entrée et la replication du virus au cours de dosages de neutralisation à base d'anticorps, l'inhibition chimique, ou la comparaison de l'efficacité antivirale 6.4. Bien que ces virus se sont révélés utiles, ils sont limités dans leur capacité à fournir des informations détaillées sur le point d'inhibition en raison de leur utilisation d'un seul promoteur précoce / tardif virale ambiguë. Les méthodes précédentes ont également fait usage de la protéine EGFP avec des caractéristiques sous-optimaux signal-bruit.
En raison de la complexité de la réplication du virus de la variole et le manque d'outils existants disponibles pour analyser les changements en temps réel de l'expression des gènes viraux, nous avons développé une série de virus rapporteurs unique et multi-étape 7,8. Comme décrit dans les publications précédentes, ces virus expriment un, deux, ou trois protéines fluorescentes spectralement distinctes de promoteurs de la vaccine indigènes au début, des étapes intermédiaires, ou à la fin de l'infection. Ces virus peuvent nous êtreed comme indicateurs de progrès réplication du virus en utilisant un microscope à fluorescence et ils conviennent aussi bien pour la plaque et-lecteur basé tests à haut débit. Ces virus sont faciles à utiliser à la place de virus de type sauvage, de plus en plus avec une cinétique similaire pour atteindre titres équivalents 7. Lors de la planification et de la création de ces virus, on a pris soin dans le choix des fluorophores ayant des caractéristiques élevées signal à fond avec une efficacité supérieure de pliage pour faciliter la quantification fiable avec retour rapide à des changements dans l'expression (Vénus, mCherry et TagBFP). En outre, des combinaisons de promoteurs viraux ont été choisis qui produisent de haute fidélité, l'expression spécifique de stade sans ambiguïté, fournissant des informations sur la gamme complète de début (promoteur C11R), intermédiaire (promoteur G8R) et la fin (promoteur F17R) l'expression des gènes, contrairement aux ambiguë promoteurs début / fin.
Ces virus peuvent être utilisés comme un outil pour investigating le cycle de vie du virus de la variole, le virus de la vaccine prototypique. Beaucoup ne sait toujours pas sur l'interaction hôte-virus malgré sa longue histoire de l'étude. Vaccine est complexe, produisant plus de 200 protéines uniques, dont beaucoup sont des immunomodulateurs et hébergent antagoniste. Lors de l'infection, le virus de la vaccine commence immédiatement tôt transcription de l'ARNm. Ceci est facilité par une ARN polymérase et des facteurs de transcription qui ont été chargés sur le génome viral lors de l'emballage du virion et détenus dans un état de pause jusqu'à ce que l'infection ultérieure. Cette expression précoce produit principalement des protéines nécessaires à la suppression du système immunitaire de l'hôte (ARNm de décapsulage, l'ARN double brin séquestration, et des protéines réceptrices leurres ainsi que des inhibiteurs de l'apoptose, la réponse au stress, et Toll, IL, et la signalisation NF-kB) et la réplication du génome. Expression précoce produit également des facteurs nécessaires à l'expression intermédiaire de transcription. Intermédiaire expression inclut l'expression de facteurs de transcription de fin d'étape. Ceexpression cascade conduit à la production de protéines structurales et enzymatiques virales au cours des stades tardifs de l'infection, qui sont nécessaires pour l'assemblage du virion complet de la vaccine mature.
Notre série de virus rapporteurs fluorescents permet de progresser plus rapidement réalisés dans la compréhension de la biologie poxvirus. L'une des méthodes les plus courantes et fastidieuses dans le domaine de la virologie est le test de croissance. Cela implique généralement l'infection des cellules, l'adoption d'une série de traitements, le virus de la récolte par la lyse des cellules infectées, et de quantifier le titre viral obtenue par dosage de plaque. Utilisation des virus rapporteurs décrits ici permet la mesure en temps réel de la croissance du virus qui peut être facilement testée et comparée entre les nombreux traitements effectués en parallèle. Nous prévoyons que cet ensemble de réactifs est utilisé dans divers protocoles pour identifier des altérations de l'expression des gènes viraux en réponse à un traitement médicamenteux, l'ARNi knockdown, ou restriction de la gamme d'hôtes.
Cette méthode permet également l'analyse à haut contenu sur une plus grande échelle qu'auparavant, permettant à haut débit de dépistage de drogues anti-viraux pour les étapes cibles spécifiquement définis d'intérêt. Alors que de nombreux traitements possibles pour lutter contre l'infection par le virus de la variole ont été identifiés, le seul approuvé par la FDA des thérapies efficaces pour le traitement de l'infection par le virus de la variole sont nucléoside acyclique phosphonate, cidofovir, et le traitement par la vaccine immunoglobuline 9,10. Malgré l'éradication de la variole en 1977 11, poxvirus restent une menace importante pour la santé humaine 12. Arrêt de la vaccination généralisée contre les virus de la variole a conduit à une sensibilité accrue à d'autres poxvirus 13. Par exemple, les régions de l'Afrique centrale qui étaient auparavant protégés par la vaccination connaissent une forte augmentation des infections par le virus monkeypox 14. Préoccupation importante a également étésoulevées au sujet de la sensibilité latente à la libération intentionnelle du virus de la variole. En raison des thérapies limitées actuellement disponibles, il ya un besoin urgent de développer de nouveaux traitements. Ces virus rapporteurs permettent le dépistage d'inhibiteur de petite molécule rapide et à haut débit pour l'inhibition d'une étape spécifique de la réplication virale. Identification d'inhibiteurs qui ciblent les stades d'expression viraux actuellement pas la cible d'inhibition facilitera le développement de thérapies de combinaison avec une puissance accrue.
Beaucoup de choses peuvent être tirées à propos de la vaccine biologie cellulaire en observant les changements dans l'expression des gènes de chaque étape. Atténuation par manipulation chimique ou génétique d'une cellule hôte infectée est généralement exprimée en termes de titres viraux réduits. Toutefois, en comparant les changements dans chaque étage de la cascade d'expression viral, on peut obtenir une compréhension plus complète de la façon de fitness viral est l'impacted par un traitement particulier. Ces données ont été montré une bonne corrélation avec la sortie traditionnelle du titre de virus, mais de fournir des informations plus détaillées mécanique ainsi que des capacités à haut débit 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit l'utilisation pratique d'un virus de la vaccine reporter multi-étape (TRPV), qui fournit reproductibles, en temps réel des mesures de rétroaction de la réplication du virus. En utilisant des inhibiteurs de poxvirus bien définis, nous avons pu montrer que TRPV répond d'une manière compatible avec le mécanisme d'action compris pour chaque inhibiteur. Alors que le virus TRPV fournit l'information la plus complète à propos de la progression de la phase de virus, en deux …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions SIGA Technologies (Corvallis, OR) pour fournir ST-246. DKR a été soutenu par une subvention de formation NIH en immunologie à l'Université de Boston (5T32AI 7309). Ce travail a été financé en partie par P41 086180, NIH RO1AI1096159-01, et SR3 (à JHC).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
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