Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica
Summary
Descriviamo l'utilizzo di un virus vaccinia reporter fluorescente che consente la misurazione in tempo reale di infettività virale e l'espressione genica attraverso l'espressione specifica fase di fluorofori giornalista spettralmente distinti. Abbiamo dettaglio un metodo basato piastra per identificare con precisione la fase in cui la replicazione del virus è influenzato in risposta ad inibizione piccola molecola.
Abstract
Poxviruses sono una famiglia di virus a DNA doppio stranded che comprendono gli agenti patogeni attivi umani, come il vaiolo delle scimmie, mollusco contagiousum e virus Contagalo. La famiglia comprende anche il virus del vaiolo, Variola. A causa della complessità della replicazione poxvirus, molte domande rimangono ancora quanto alla strategia espressione genica. In questo articolo descriviamo la concettualizzazione e l'utilizzo di virus vaccinia ricombinanti che consentono la misurazione in tempo reale di fasi singole e multiple di espressione genica virale in un formato ad alta velocità. Ciò è reso possibile attraverso l'uso di proteine fluorescenti spettralmente distinti come reporter per ciascuna delle tre fasi di replicazione virale. Questi virus forniscono un elevato rapporto segnale-rumore, pur mantenendo i modelli fase specifica espressione, consentendo analisi basate piastra-e osservazioni microscopiche di propagazione dei virus e replicazione. Questi strumenti hanno usi per la scoperta antivirale, studi di interazione virus-ospite, e bio evolutivalogia.
Introduction
Tradizionalmente, l'espressione virus viene studiata utilizzando tecniche di biologia molecolare (ad esempio blotting settentrionale, occidentale blotting, ibridazione microarray, ecc) 1. Mentre questi metodi sono in grado di fornire informazioni dettagliate riguardo al categorizzare cambiamenti di espressione di singoli mRNA o proteine, non sono in genere riconducibili a processi real-time e high-throughput. Approcci alternativi che utilizzano i giornalisti a base di fluorescenza sono state applicate in precedenza quando si lavora con poxviruses; tuttavia, il loro sviluppo e il loro utilizzo è stato motivato da finalità diverse. Diversi di questi metodi sono stati progettati per la selezione di virus ricombinanti 2,3. Queste tecniche esprimono EGFP sulla corretta costituzione e l'espressione del DNA esogeno da cloni vaiolo vaccino ricombinanti. Analogamente, diversi ceppi vaccinia esprimono stabilmente EGFP solubile o proteine GFP-tag espresse sotto un promotore nativo vaccinia sono stati ampiamente utilizzati. Questi sono tipcamente utilizzato per quantificare ingresso virus e replica durante test di neutralizzazione a base di anticorpi, inibizione chimica, o il confronto di efficacia antivirale 4-6. Mentre questi virus si sono dimostrati utili, essi sono limitati nella loro capacità di fornire informazioni dettagliate sul punto di inibizione a causa del loro utilizzo di un unico promotore ambiguo anticipo / ritardo virale. Metodi precedenti hanno anche fatto uso di proteina EGFP con caratteristiche ottimali segnale-rumore.
A causa della complessità della replicazione poxvirus e la mancanza di strumenti disponibili per saggiare tempo reale i cambiamenti nell'espressione genica virale, abbiamo sviluppato una serie di virus singolo e multi giornalista fase 7,8. Come descritto in precedenti pubblicazioni, questi virus esprimono uno, due, o tre proteine fluorescenti spettralmente distinti da promotori vaiolo vaccino indigene durante le prime fasi, tappe intermedie, o tardive dell'infezione. Questi virus possono essere noied indicatori di progresso replicazione del virus utilizzando un microscopio a fluorescenza e sono ugualmente adatti per high-throughput piastra-e-reader basato saggi. Questi virus sono facili da usare al posto di tipo selvatico del virus, in crescita con cinetiche simili per raggiungere i titoli equivalenti 7. Durante la progettazione e la realizzazione di questi virus, molta cura è stata posta nella scelta fluorofori che presentano elevate caratteristiche segnale-fondo con efficienza superiore pieghevole per facilitare la quantificazione affidabile con un feedback rapido ai cambiamenti di espressione (Venere, mCherry e TagBFP). Inoltre, le combinazioni di promotori virali sono stati scelti che producono alta fedeltà, espressione inequivocabile stadio-specifica, che fornisce informazioni sulla gamma completa di precoce (promotore C11R), intermedio (promotore G8R) e (promotore F17R) espressione genica tardi, in contrasto ambiguo promotori anticipo / ritardo.
Questi virus possono essere usati come strumento per investigating il ciclo di vita del poxvirus prototipo, virus del vaiolo vaccino. Molto non è ancora noto circa l'interazione ospite-virus nonostante la sua lunga storia di studio. Vaccinia è complesso, producendo oltre 200 proteine uniche, molte delle quali sono immunomodulante ospitano antagonista. Dopo l'infezione, il virus del vaiolo vaccino comincia subito all'inizio del mRNA di trascrizione. Ciò è facilitato da una RNA polimerasi e fattori di trascrizione che sono stati caricati sul genoma virale durante il confezionamento virione e tenuti in uno stato di pausa fino a successiva infezione. Questo primo espressione produce principalmente proteine necessarie per la soppressione del sistema immunitario dell'ospite (mRNA decapping, dsRNA sequestro, e proteine recettori decoy così come inibitori di apoptosi, risposta allo stress, e Toll, IL, e segnalazione NF-kB) e la replicazione del genoma. Espressione precoce produce anche fattori di trascrizione necessari per l'espressione intermedio. Espressione intermedio comprende l'espressione di fattori di trascrizione fase tardiva. Questoespressione cascata porta alla produzione di proteine virali strutturali ed enzimatiche durante ultimi stadi di infezione, che sono necessarie per completare l'assemblaggio del virione maturo vaccinia.
La nostra serie di virus reporter fluorescente consente la rapida compiere progressi nella comprensione della biologia poxvirus. Uno dei metodi più comuni e che richiede tempo nel campo della virologia è il saggio di crescita. Ciò comporta tipicamente infettare le cellule, che introduce una serie di trattamenti, virus raccolta mediante lisi cellule infettate, e quantificare il titolo virale risultante da saggio di placca. Usando i virus giornalista qui descritti consente la misurazione in tempo reale della crescita virale che può essere facilmente dosato e confrontata tra numerosi trattamenti eseguiti in parallelo. Prevediamo questa serie di reagenti sarà utilizzato in vari protocolli per identificare alterazioni dell'espressione genica virale in risposta al trattamento farmacologico, RNAi knockdown, o la restrizione campo ospite.
Questo metodo consente anche l'analisi ad alto contenuto su scala più ampia rispetto al passato, consentendo di high-throughput schermi di farmaci anti-virali per le fasi di destinazione specificamente definite di interesse. Mentre sono stati identificati numerosi potenziali trattamenti per combattere l'infezione da poxvirus, l'unico approvato dalla FDA terapie efficaci per il trattamento delle infezioni da poxvirus sono il nucleoside aciclico fosfonato, cidofovir, ed il trattamento con vaccino immunitario globulina 9,10. Nonostante l'eradicazione del vaiolo nel 1977 11, poxviruses rimangono una grave minaccia per la salute umana 12. Cessazione della vaccinazione diffusa contro il virus del vaiolo ha portato ad un aumento della suscettibilità alle altre poxviruses 13. Ad esempio, regioni dell'Africa centrale precedentemente protetti dalla vaccinazione stanno vivendo un aumento di infezioni da virus vaiolo delle scimmie 14. Preoccupazione significativa è stata anchesollevato in merito alla predisposizione latente di rilascio intenzionale di virus Variola. A causa delle limitate terapie attualmente disponibili, vi è una necessità urgente per lo sviluppo di nuovi trattamenti. Questi virus giornalista consentono una rapida e high-throughput di screening piccolo inibitore della molecola per l'inibizione di una determinata fase di replicazione virale. Identificazione di inibitori che mirano fasi di espressione virali attualmente l'obiettivo di inibizione faciliterà lo sviluppo di terapie combinate con una maggiore potenza.
Molto può essere spigolato su vaccino biologia cellulare osservando i cambiamenti nell'espressione genica di ogni fase. Attenuazione da chimica o manipolazione genetica di una cellula ospite infettata è solitamente espressa in termini di titoli virali ridotte. Tuttavia, comparando le variazioni di ogni fase della cascata di espressione virale, si può ottenere una comprensione più completa di come idoneità virus è impattoEd da un particolare trattamento. Questi dati hanno dimostrato di correlare bene con la tradizionale uscita titolo virale, ma fornire informazioni più dettagliate meccanicistica nonché capacità high throughput 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto l'uso pratico di un multi-stadio di virus del vaiolo vaccino reporter (TrpV), che fornisce riproducibili, misure di feedback in tempo reale di replicazione del virus. Utilizzando inibitori poxvirus ben definite, siamo stati in grado di dimostrare che TrpV risponde in modo coerente con il meccanismo capito di azione per ciascun inibitore. Mentre il virus TrpV fornisce le informazioni più complete sulla progressione fase virus, due stadi (IREV, LREV) e monostadio (EV, IV, LV) virus possono esse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo SIGA Technologies (Corvallis, OR) per la fornitura di ST-246. DKR è stato sostenuto da una borsa di formazione NIH in immunologia alla Boston University (5T32AI 7309). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, e RO3 (a JHC).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
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