유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

요약

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

초록

폭스 바이러스 활성 인간과 같은 monkeypox에 같은 병원체, 전염성의 contagiousum 및 Contagalo 바이러스를 포함 이중 가닥 DNA 바이러스의 가족입니다. 이 제품군은 또한 천연두 바이러스, 천연두를 포함한다. 인해 폭스 바이러스 복제의 복잡성, 많은 질문들은 여전히​​ 유전자 발현 전략에 대하여 남아있다. 이 문서에서 우리는 높은 처리량 형식의 바이러스 유전자 발현의 단일 및 다중 단계의 실시간 측정을 가능하게 재조합 우두 바이러스의 개념화 및 사용에 대해 설명합니다. 이것은 바이러스 복제의 세 단계 각각에 대한 기자로서 스펙트럼 별개의 형광 단백질의 사용을 통해 사용할 수 있습니다. 스테이지 별 발현 패턴, 가능하게 플레이트 - 기반 분석법 및 바이러스 전파 및 복제의 현미경 관찰을 유지하면서 이러한 바이러스는 높은 신호 대 잡음비를 제공한다. 이 도구는 바이러스 검색, 바이러스 호스트 상호 작용의 연구, 진화 생물에 대한 용도가의 뜻.

서론

전통적으로, 바이러스 발현 분자 생물학 기술 (예를 들면 북부 블로 팅, 웨스턴 블롯, 마이크로 어레이 하이브리드 ^등)를 사용하여 공부한다. 이러한 방법은 개인의 mRNA 또는 단백질의 발현 변화를 범주화에 대해 상세한 정보를 제공 할 수 있지만, 그들은 일반적으로 실시간 및 높은 처리량 프로세스에 순종하지 않다. 폭스 바이러스 작업을 할 때 형광 기반의 기자를 사용하여 다른 방식의 접근은 이전에 적용되었습니다; 그러나, 자신의 개발과 사용은 다양한 목적에 의해 동기 부여를하고있다. 몇 가지 이러한 방법은 재조합 바이러스 ^2,3의 선택을 위해 설계되었습니다. 이 기술은 적절한 결합 재조합 우두 클론에서 외래 DNA의 발현에 EGFP을 표현한다. 마찬가지로, 여러 우두 균주 안정적으로 용해 EGFP을 표현하거나 기본 우두 프로모터에서 표현 GFP - 태그 단백질은 널리 사용되어왔다. 이들은 일반 있습니다ically 바이러스 항목 및 복제 항체 기반의 중화 분석하는 동안, 화학 억제, 또는 항 바이러스 효과 ^4-6의 비교를 정량화하는 데 사용됩니다. 이 바이러스가 유용한 입증하는 동안, 그들은 하나 때문에 모호한 말 / 초기 바이러스 성 프로모터의 자신의 사용을 억제 포인트에 대한 자세한 정보를 제공 할....

프로토콜

1. 플레이트 세포

1. 판에서 HeLa 세포를 떼어 놓다 약 2.0 × 10 ⁵ 세포 / ml로 성장 배지 (DMEM, 2 MM의 L-과잉, 10 % FBS)에 희석. 검은 벽, 분명 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 (20,000 세포 / 웰)에 100 μL / 잘 분배.
2. + 5 % CO ₂ 37 ° C 배양기에 합류 할 때까지 24 시간 동안 세포를 품어.

2. 세포를 감염

1. 바이러스를 희석하고 세포를 감염.
   1. 해동 TrpV (트리플 바이러스, 조기 금성, 중급 mCherry, 늦은 TagBFP)과 PLV (발기인없는 비너스) 형광 바이러스와 5 분 동안 초음파를 사용하여 해리하는. 또한, 원유 바이러스 주식 감염 매체에 0.25 ㎎ / ㎖ 트립신 1:1로 혼합하여 30 분 동안 37 ° C에서 배양 할 수있다.
   2. 37 ° C 감염 미디어 (DMEM, 2 MM의 L-과잉, 2 % FBS)에서 원유 바이러스 주식을 희석. 높은 MOI 감염 (10 PFU / 셀)의 경우, PFU는 / ㎖ 5 × ^{4 가정} 1.0 × 10 ⁷ 바이러스 주식을 희석잘 세포 / 50 μL의 접종....

결과

이러한 바이러스의 일반적인 사용의 예로서, 삼중 형광 리포터 바이러스는 몇개의 잘 정의 된 폭스 바이러스 억제제의 억제의 점과 비교하기 위해 사용되었다.

헬라 세포는 검은 벽으로 둘러싸인 맑은 평면 바닥 96 - 웰 플레이트를 처리하고 하룻밤 배양 조직 문화에서 도금했다. (TrpV, 표 1) 합류 단층은 트리플 기자 바이러스를 사용하여 10의 감염의 다중성 (MOI)에 감염 또는 프로모터 이하 금성 판지도 (그림 1)에 설명 된대로 (PLV). 치료를 함유 감염 매체는 0.1 % DMSO, 3.6 μM (1 ㎍ / ㎖)의 최종 농도를 얻기 위해 추가되었다 ARAC, 50 μM (11.7 ㎍ / ㎖) IBT, 5 μM (1.9 ㎍ / ㎖) ST-246 또는 60 μM 세중 (50 ㎍ / ㎖) 리팜피신. 모든 주식은 DMSO에 1 μL / ml로 사용 된 이후 억제제 0.1 % DMSO가 차량 제어로서 사용 하였다. .......

토론

여기, 우리는 바이러스 복제의 재현, 실시간 피드백 조치를 제공하는 다단계 우두 기자 바이러스 (TrpV)의 실제 사용을 설명했다. 잘 정의 된 폭스 바이러스 억제제를 사용하여, 우리는 TrpV 각 억제제에 대한 행동의 이해 메커니즘에 부합하는 방식으로 응답하는 것을 보여줄 수 있었다. TrpV 바이러스는 바이러스 스테이지 진행에 대한 가장 포괄적 인 정보를 제공하고 있지만, 두 단계 (IREV, LREV) 및 단일 단계 (EV, IV, LV) 바이러스는 또한 최적의 단백질 폴딩을 활용, 유사하게 이용 될 수있다, 안정성, 금성의 형광 물질과 우수한 신호 대 잡음비.

이 프로토콜의 개념 증명 분석은 간단하고, 높은 처리량 플레이트 분석에서 알려진 폭스 바이러스 억제제에 의해 영향을 바이러스 성 유전자 발현의 단계를 식별의 가능성을 나타냅니다. 이 분석은 신속하고 종합적인 심사를 완료하도록 확장 할 수 있습니다알 수없는 화학 물.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-글루타민, (L-글럿)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트	Corning	3603
384 웰 플랫 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 TC 처리 마이크로 플레이트	Corning	3712
Trypsin, 2X, 멸균, 방사선 조사	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
인산염 완충 식염수(PBS)	Gibco	10010-023
디메틸설폭사이드, 세포 배양(DMSO)	미국 생물분석	AB03091
1-&베타;-D-아라비노푸라노실시토신  (AraC), MW= 280g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone(IBT), MW= 234g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액	전자 현미경 Sciences	157-8
TempPlate RT 광학 투명 필름	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM 저감 세럼 미디엄	Gibco	31985-070