Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler
Summary
Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.
Abstract
Poxvirüsler aktif insan gibi Monkeypox gibi patojenleri, molluscum contagiousum ve Contagalo virüsü, çift sarmallı DNA virüsleri bir aileyiz. Aile de çiçek virüsü, Variola içerir. Nedeniyle poksvirüs çoğaltma karmaşıklığı, pek çok soru hala gen ekspresyon stratejisine ilişkin kalır. Bu yazıda, bir yüksek verimli bir biçimde viral gen ekspresyonu, tek ve çok sayıda etap gerçek zaman ölçümünü sağlayacak rekombinant vaccinia virüsleri kavramsallaştırılmasını ve kullanımını tarif eder. Bu, viral replikasyon üç aşamada her biri için ayrı bir muhabir olarak, spektral floresan proteinlerinin kullanımı ile etkinleştirilir. Aşama özel ekspresyonu, etkinleştirme plaka bazlı tahliller ve virüs yayılması ve replikasyon mikroskobik gözlemler korurken Bu virüsler yüksek sinyal-gürültü oranını sağlar. Bu araçlar antiviral keşif, virüs-konak etkileşim çalışmaları, ve evrimsel biyo için kullanan varlogy.
Introduction
Geleneksel olarak, virüs ifade moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, Kuzey leke, western blot, mikrodizi hibridizasyon, vb) 1 kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemler bireysel mRNA veya protein ifadesini değiştirir kategorize ile ilgili detaylı bilgi sağlama yeteneğine sahip olsa da, bunlar genellikle gerçek zamanlı ve yüksek verimli işlemlere uygun değildir. Poksvirüslerden çalışırken floresan tabanlı gazetecilere kullanarak alternatif yaklaşımlar önceden uygulanmış; Ancak, onların gelişimi ve kullanımı çeşitli amaçlarla tarafından motive edilmiştir. Bu gibi birkaç yöntem rekombinant virüslerin 2,3 seçimi için tasarlanmıştır. Bu teknikler dahil edilmesi ve uygun rekombinant vaccinia klonlardan eksojen DNA'nın sentezlenmesi üzerine EGFP ifade eder. Benzer şekilde, birçok aşı suşları stabil bir şekilde çözünür EGFP ifade eden ya da yerel bir ineklerdeki çiçek hastalığı promotörün kontrolü altında eksprese GFP-etiketli proteinler, yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tip vardırically virüs giriş ve replikasyon antikor bazlı nötralizasyon deneyleri sırasında, kimyasal önleme veya antiviral etkinliği 4-6 karşılaştırma ölçmek için kullanılır. Bu virüsler yararlı olduğu kanıtlanmış olsa da, onlar yüzünden bir tek muğlak erken / geç viral desteğin onların kullanımına engellenmesi noktası hakkında detaylı bilgi vermek için kendi yeteneği sınırlıdır. Önceki yöntemler de optimal sinyal-gürültü özellikleri ile EGFP protein kullanımı yaptık.
Nedeniyle poksvirüs çoğaltma ve viral gen ifadesinde gerçek zamanlı değişiklikleri tahlil için kullanılabilir mevcut araçların eksikliği karmaşıklığı, biz tek ve çok kademeli muhabiri virüsler 7,8 paketi geliştirdik. Daha önceki yayınlarda tarif edildiği gibi, bu virüsler, erken enfeksiyon içinde bir ara madde ya da geç aşamaları sırasında bir, iki, veya yerel vaccinia promoterler üç ayrı spektral floresan proteinleri ifade eder. Bu virüsler bizi olabilirflöresanlı bir mikroskop kullanılarak virüs replikasyonu ilerleme göstergesi olarak ed ve yüksek verimli ve plaka-okuyucu bazlı tahliller için de aynı derecede uygundur. Bu virüsler eşdeğer titreleri 7 ulaşmak için benzer kinetik ile büyüyen, yabani tip virüs yerine kullanmak kolaydır. Planlama ve bu virüslerin yaratılması sırasında, çok bakım ifadesi (Venüs, mCherry ve TagBFP) değişikliklere hızlı bir geri besleme ile güvenilir ölçümü kolaylaştırmak için üstün katlama verimlilik ile yüksek sinyal-zemin özelliklerine sahip florosforlar seçiminde alındı. Ek olarak, viral promoterlerin kombinasyonları belirsiz aksine, yüksek bağlılık, açık safha spesifik ifadesi, (C11R promoter) erken dizi hakkında bilgi veren, ara madde (G8R promotör) ve geç (F17R promoter) gen ekspresyonunu üreten seçilmiştir erken / geç promoterleri.
Bu virüsler inve için bir araç olarak da kullanılabilirPrototipik çiçek virüsü, vaccinia virüs yaşam döngüsünü stigating. Çok çalışmanın uzun tarihine rağmen hala konak-virüs etkileşimi hakkında bilinen değildir. Vaksiniya immunomodulator ve uzlaşmaz ev sahipliği birçoğu 200 üzerinde benzersiz proteinlerini üreten, karmaşık. Enfeksiyon üzerine, ineklerdeki çiçek hastalığı virüsü erken hemen mRNA transkripsiyonunu başlar. Bu virion paketleme sırasında viral genom üzerinde yüklenir ve daha sonraki enfeksiyonlar kadar durdurulmuş halde yapıldı bir RNA polimeraz ve transkripsiyon faktörleri tarafından kolaylaştırılır. Bu erken ifade esas konakçı bağışıklık sistemi (mRNA Dekapaj, dsRNA sekestrasyon ve yem reseptör proteinleri hem de apoptoz inhibitörleri, stres tepkisi ve Toll, IL, ve NF-KB sinyal) ve genom replikasyon bastırılması için gerekli proteinler üretir. Erken ifade aynı zamanda ara ekspresyon için gerekli transkripsiyon faktörlerini üretir. Ara madde ifade geç aşama transkripsiyon faktörlerinin ortaya çıkarılmasını içerir. Buifade kademeli olgun vaccinia virionun tam montaj için gerekli olan enfeksiyonun geç aşamalarında sırasında yapısal ve enzimatik virüs proteinlerinin üretimine yol açar.
Floresan haberci virüslerinin Bizim grubu poksvirüs biyoloji anlaşılmasında yapılacak hızlı bir ilerleme sağlar. Viroloji alanında en yaygın ve zaman alıcı bir yöntemlerden biri büyüme deneyidir. Bu, tipik olarak, hücrelerin enfekte enfekte hücreleri lize ile tedaviler, hasat virüs bir dizi yürürlüğe koymak ve plak tahlili ile elde edilen viral titresi miktarının içerir. Burada açıklanan raportör virüs kullanılarak kolayca deneye tabi tutulur ve paralel olarak gerçekleştirilen işlemler arasında çok sayıda mukayese edilebilir virüs büyüme gerçek zaman ölçümünü sağlar. Bu reaktifler, bu dizi ilaç tedavisi, RNAi k tepki olarak viral gen ekspresyonunda değişiklikler belirlenmesi için çeşitli protokoller kullanılacak öngörmeknockdown, veya konak aralığı kısıtlama.
Bu yöntem de ilginç spesifik olarak tanımlanmış hedef aşamaları için yüksek verimli bir anti-viral ilaç ekranlar için izin veren, önceden mevcut olandan daha büyük bir ölçekte, yüksek içerik analizini sağlar. Çiçek virüsü enfeksiyon ile mücadele etmek için çok sayıda olası tedaviler tespit edilmiş olsa da, sadece FDA çiçek virüsü enfeksiyonunun tedavi edilmesi için etkili tedaviler Asiklik nükleosit fosfonat, Cidofovir, ve vaccinia immün globulin 9,10 ile tedavi edilir onayladı. 1977 11 çiçek eradikasyonu rağmen, poxvirüsler insan sağlığı 12 için önemli bir tehdit olmaya devam etmektedir. Variola virüsüne karşı yaygın aşılama bırakma diğer çiçek virüsleri 13 için artmış duyarlılık yol açmıştır. Örneğin, daha önce aşılama tarafından korunan Orta Afrika bölgelerinde Monkeypox virüs enfeksiyonlarına 14 bir artış yaşanıyor. Önemli endişe de olmuşturVariola virüsün kasıtlı serbest bırakılması için gizli duyarlılık konusunda kaldırdı. Nedeniyle, şu anda mevcut olan sınırlı tedavilere, yeni tedavilerin geliştirilmesi yönünde acil bir ihtiyaç vardır. Bu raportör virüsler, viral replikasyonun spesifik bir aşamasının önlenmesi için hızlı ve yüksek verimli, küçük molekül inhibitörü, tarama izin verir. Inhibisyon anda değil hedef viral sentezleme evreleri hedefleyen önleyicilerinin tespiti yüksek etki ile kombinasyon tedavilerinin geliştirilmesini kolaylaştırır.
Kadar her aşamanın gen ifadesi değişikliklerini gözlemleyerek aşı hücre biyolojisi hakkında toplanan olabilir. Kimyasal ya da enfekte olmuş konakçı hücrenin genetik manipülasyonu ile zayıflatılması tipik haliyle düşük viral titreleri cinsinden ifade edilir. Ancak, viral sentezleme kaskadının her safhasında değişiklik karşılaştırarak, bir virüs uygunluk etkisinin ne kadar daha kapsamlı bir anlayış elde edebilirsinizBelirli bir tedavi ile ed. Bu veriler geleneksel virüs titresi çıkışı ile iyi bir korelasyon, ancak daha detaylı bilgi mekanistik hem de yüksek miktarda 7 yetenekleri temin ettiği gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, virüs replikasyonu, tekrar üretilebilir, gerçek zamanlı geri besleme ölçütleri temin eden bir çok-aşamalı vaccinia raportör virüsü (TRPV), pratik kullanımını tarif etmişlerdir. Iyi tanımlanmış bir çiçek virüsü inhibitörleri kullanarak, TRPV her bir inhibitör için eylem mekanizması ile anlaşılır uygun bir şekilde tepki olduğunu gösterebilmişlerdir. TRPV virüs virüs evre ilerleme hakkında en kapsamlı bilgi sunarken, iki aşamalı (IREV, LREV) ve tek kademeli (EV, IV, LV) vir?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz ST-246 sağlamak için SIGA Teknolojileri (Corvallis, OR) teşekkür ederim. DKR Boston Üniversitesi (5T32AI 7309) için immünoloji bir NIH eğitim bursu ile desteklenmiştir. Bu çalışma P41 086180 tarafından kısmen desteklenen, NIH RO1AI1096159-01, ve RO3'ü (JHC için).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum – Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas–monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
