-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em> Drosophila</em> Weefsels<em> In Situ</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Studies uitgevoerd in Drosophila melanogaster embryo's en larven leveren cruciale inzicht in ontwikkelingsprocessen zoals lot van de cel specificatie en organogenese. Immunokleuring maakt de visualisatie van ontwikkelende weefsels en organen. Echter, een beschermende cuticula die zich vormt aan het eind van embryogenese voorkomt permeatie van antilichamen in late-embryo's en larven. Terwijl dissectie voor immunokleuring wordt regelmatig gebruikt om Drosophila larvale weefsels analyseren inefficiënt sommige analyses blijkt omdat kleine weefsels moeilijk kan zijn te lokaliseren en te isoleren. Sonicatie biedt een alternatief voor dissectie in larvale Drosophila immunostaining protocollen. Het maakt een snelle, gelijktijdige verwerking van grote aantallen late-embryo's en larven en onderhoudt in situ morfologie. Na fixatie in formaldehyde, wordt een monster gesonificeerd. Monster wordt vervolgens onderworpen aan immunokleuring met antigen-specifiek primair antibodies en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen aan doelcel types en specifieke proteïnen te visualiseren via fluorescentiemicroscopie. Tijdens het proces van sonicatie, juiste plaatsing van een sonicatie sonde boven het monster, alsmede de duur en intensiteit van sonicatie, kritisch. Additonal kleine wijzigingen standaard immunokleuring protocollen die noodzakelijk zijn voor hoge kwaliteit vlekken. Op antilichamen met een lage signaal-ruisverhouding, langere incubatietijden zijn typisch noodzakelijk. Als een proof of concept voor deze-geluidsgolven gefaciliteerd protocol, laten we immunostains van drie soorten weefsel (testikels, eierstokken, en zenuwweefsel) op een afstand van ontwikkelingsstadia.

Introduction

Drosophila embryo's en larven bieden een uitstekend model om ontwikkelingsprocessen te studeren in veel organen en weefsels. Beeldvorming van afzonderlijke cellen is vaak noodzakelijk in deze studies om de complexe omgevingen waarin cellen ontwikkelen bepalen. Visualisatie van cellen in weefsels kunnen worden bereikt door immunokleuring. Goed beschreven immuunkleuring protocollen bestaan ​​voor embryonale Drosophila weefsels <17 uur na de eileg (AEL) ^1-3. Echter, een beschermende cuticula vormt tegen het einde van embryogenese voorkomende effectieve antilichaam permeatie. Aldus zijn deze immunokleuring protocollen inefficiënt in de analyse van weefsels in late-stadium embryo en in latere fasen van larvale ontwikkeling ^(1e instar (L1), ^2e instar (L2) en ^3e instar (L3)). Deze inefficiëntie legt een barrière voor ons begrip van de dynamische processen die optreden tijdens deze uitgebreide ontwikkelingsperiode ^4. Tissue dissectie is een uitgebreid toegepast techniek om deze barrière ^5-7 omzeilen. Echter, dissectie ondoeltreffend. Extractie kan worden bezwaard door de moeilijkheden bij het lokaliseren of het isoleren van embryonale en larvale weefsels. Verder kan de fysieke verwijdering van doelwitweefsels schade veroorzaken door scheuren hen of door niet uitpakken in hun geheel.

Sonicatie is een methode die geluidsgolven maakt gebruik van intermoleculaire interacties te verstoren. Het is gebruikt om de integriteit van de Drosophila larven cuticula verstoren om immunostain ontwikkelen neurale celtypes ^6. Dit protocol is aangepast om late-fase embryonale en larvale geslachtsklieren, van slechts 50 urn diameter ^8-10 kan immunostain. Door middel van deze studies, is het proces van de mannelijke kiembaan stamcellen (GSC) niche-formatie werd gekenmerkt in een vergevorderd stadium Drosophila embryo's ^8-10 en mechanismen tot regeling van stamcellen ontwikkeling en differentiatie in een vergevorderd stadium embryonale gonaden en larven zijn opgehelderd ^9-12. Aldus sonicatie biedt een efficiënt alternatief voor weefsel dissectie die kan moeilijk zijn vanwege weefselgrootte. Bovendien maakt immunokleuring van Drosophila weefsels in situ, waardoor cellen in de context van het hele organisme en handhaven situ morfologie. Hier is een stap-voor-stap protocol voor fluorescentie immunokleuring van late-fase embryonale beschrijven we door vroege / midden-L3 weefsels in situ. Analyse van Drosophila gonadale en neuraal weefsel in de Representatieve resultaten voor de werkzaamheid van dit protocol aangetoond. Bovendien kan dit immunokleuring protocol worden aangepast aan andere Drosophila weefsels en weefsels in andere organismen te analyseren met een buitenste cuticula.

Protocol

1 Voorbereiding van een collectie Cage Verdoven jonge, vruchtbare vliegen met CO 2. Transfer verdoofde vliegt naar een kooi. Om optimale opbrengst te verkrijgen, gebruik 100-120 volwassen vliegen variëren van 2-7 dagen oud op een 4: 1 verhouding vrouwtjes mannetjes. Laat vliegt een passende acclimatiseringsperiode, ~ 24 uur voorafgaand aan het verkrijgen monster voor fixatie. Als de kooi werd opgezet met maagdelijke vrouwtjes gepaard met mannen, een gebruik van een 36 – hr acclimatiseringsperiode …

Representative Results

Om de werkzaamheid van sonicatie gebaseerde immunokleuring in analyse van laat-stadium embryonale en larvale weefsels in situ aantonen, werden wildtype embryo's en larven bewerkt voor immunokleuring van testes, ovaria en zenuwweefsel. Monsters werden afgebeeld via confocale microscopie en representatieve resultaten worden getoond (Figuur 1 en Figuur 2). Resultaten blijkt dat het beschreven protocol is effectief voor het visualiseren van morfologische kenmerken als individue…

Discussion

Dit protocol verschaft een werkwijze succesvol immunostain richten Drosophila embryonale en larvale weefsels in situ, waardoor de noodzaak voor dissectie. Als per eerdere protocollen voor het kleuren van de vroege embryo's ^1,2,3, is het chorion membraan verwijderd met behulp van 50% bleekwater (NaOCl). Monsters worden gefixeerd in formaldehyde en methanol. Omdat de larvale cuticula veroorzaakt oudere monster drijven, wordt het gehele monster vervolgens door een cel-zeef om larvale retent…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter