साबुत माउंट बीजाणु में में chromatin संशोधन और परमाणु वास्तुकला के मात्रात्मक, एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एक कारगर तरीका<em> एराबिडोप्सिस</em
Summary
हम immunostaining, बगल में संकरण में प्रतिदीप्ति, पूरे माउंट Arabidopsis thaliana बीजाणु में मात्रात्मक, उच्च संकल्प इमेजिंग द्वारा पीछा डीएनए धुंधला के लिए यहाँ एक कुशल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस पद्धति का सफलतापूर्वक chromatin संशोधन और परमाणु वास्तुकला का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
Abstract
फूल पौधों में, दैहिक करने वाली प्रजनन कोशिका भाग्य संक्रमण वयस्क संयंत्र के पुष्प अंगों में बीजाणु मां कोशिकाओं की विशिष्टता (एसएमसी) द्वारा चिह्नित किया गया है. महिला एसएमसी (megaspore मां सेल, एमएमसी) बीजांड उत्स में differentiates और अर्धसूत्रीविभाजन आए. चयनित अगुणित megaspore फिर एक साथ सहायक कोशिकाओं के साथ, युग्मक को जन्म देगा जो बहुकोशिकीय महिला gametophyte, अंडा सेल और केंद्रीय सेल के लिए फार्म का पिंजरे का बँटवारा आए. बीजांड अंदर एमएमसी, meiocyte और महिला gametophyte के सीमित पहुँच कोशिकाविज्ञान के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और cytogenetic एकल कोशिका के स्तर पर विश्लेषण करती है. विशेष रूप से, सेलुलर या परमाणु epitopes के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष immunodetection संयंत्र सेल और एकल कोशिका इमेजिंग अंदर अभिकर्मकों के गरीब प्रवेश द्वारा बिगड़ा हुआ है पूरे माउंट ऊतकों में ऑप्टिकल स्पष्टता के अभाव के कारण पट्टान्तरित है.
इस प्रकार, हम Nucl का विश्लेषण करने के लिए एक कारगर तरीका विकसितपूरे माउंट एम्बेडेड एराबिडोप्सिस बीजाणु में एकल कक्ष के उच्च संकल्प पर कान संगठन और chromatin संशोधन. यह एक सूक्ष्म स्लाइड पर acrylamide जेल की एक पतली परत में विच्छेदन और तय बीजाणु के embedding पर आधारित है. एम्बेडेड बीजाणु immunostaining अभिकर्मकों के लिए ऊतक स्पष्टता और पारगम्यता में सुधार लाने के लक्ष्य रासायनिक और enzymatic उपचार के अधीन हैं. उन उपचार सेलुलर और chromatin संगठन, डीएनए और प्रोटीन epitopes रक्षा करता है. नमूने chromatin immunostaining, सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति, और हेट्रोक्रोमैटिन विश्लेषण के लिए डीएनए धुंधला सहित विभिन्न डाउनस्ट्रीम कोशिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3D पुनर्निर्माण द्वारा पीछा उच्च संकल्प के साथ लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (CLSM) इमेजिंग,, एकल कोशिका प्रस्ताव पर मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता है.
Introduction
फूल पौधों में, प्रजनन प्रजातियों की स्थापना एसएमसी का भेदभाव, महिला एमएमसी और पुरुष छोटे छोटे छिद्रों वाला कीडा जो दूसरों पर पलता है माँ सेल के साथ शुरू होता है. एमएमसी बीजांड उत्स के बाहर का नोक पर एक उप एपिडर्मल nucellar सेल से विकसित करता है, और छोटे छोटे छिद्रों वाला कीडा जो दूसरों पर पलता है मां सेल गहरी पुष्प अंगों 1 अंदर स्थित हैं जो परागपिटक locule, में sporogenous ऊतक से विकसित करता है. एसएमसी तो पिंजरे का बँटवारा पर gametophytes को जन्म दे जो अगुणित बीजाणुओं, निर्माण करने के लिए अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरना. महिला gametophyte, या भ्रूण थैली, एक अंडा सेल, एक केंद्रीय सेल, दो synergids और तीन antipodals के होते हैं. पुरुष gametophyte, या पराग, एक वनस्पति सेल और दो शुक्राणु कोशिकाओं से बना है. पुरुष gametophyte एक अपेक्षाकृत सुलभ वस्तु का अध्ययन बनी हुई है, वहीं महिला gametophyte ही फूल कापेल में संलग्न, बीजांड अंदर एम्बेडेड, और इस प्रकार आणविक और कोशिका संबंधी विश्लेषण के लिए विशिष्ट चुनौती बन गया है. हाल ही में, हालांकि, लेजर की सहायताmicrodissection transcriptomic एमएमसी और महिला gametophytic कोशिकाओं 2-4 में विश्लेषण करती है की अनुमति एक सुरुचिपूर्ण समाधान की पेशकश की. उम्मीदवार जीन अभिव्यक्ति के अलावा कोशिकीय विश्लेषण विशिष्ट प्रत्यक्ष सेलुलर धुंधला या अप्रत्यक्ष immunostaining का उपयोग अंतर्जात सेलुलर घटकों की गतिशीलता की जांच, सीटू संकरण या पत्रकार जीन assays में जैसे शाही सेना की अनुमति देता है, का उपयोग का विश्लेषण करती है. विशेष रूप से, एक साथ chromatin संशोधन या chromatin घटकों के immunostaining के साथ, मछली और डीएनए धुंधला का उपयोग cytogenetic धुंधला एराबिडोप्सिस 5 में chromatin गतिशीलता और परमाणु संगठन को स्पष्ट करने के लिए केंद्रीय दृष्टिकोण हैं. आमतौर पर, अर्धसूत्रीविभाजन अच्छी तरह 6,7 meiocytes संयंत्र पुरुष में जांच की गई है जो विशिष्ट गुणसूत्र गतिशीलता पर जोर देता; संभावना गतिशील epigenetic reprogramming दर्शाती आगे बड़े पैमाने पर, सेल विशिष्ट chromatin पुनर्गठन, पराग विकास 8-10 दौरान वर्णित किया गया है. इसके विपरीत, कारणमहिला meiocyte और gametophyte के रिश्तेदार पहुंच के लिए, इन जांच को लागू करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल बने हुए हैं, और अक्सर (नीचे देखें) सेक्शनिंग या मैनुअल विच्छेदन और enzymatic पाचन की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, पूरे माउंट में ऑप्टिकल स्पष्टता की प्रचलित कमी बरकरार बीजाणु में प्रजनन कोशिकाओं की उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक बाधा है.
पूरे माउंट बीजाणु में गुणसूत्र संगठन की कोशिका संबंधी विश्लेषण के लिए एक शास्त्रीय विधि Feulgen के धुंधला 11-13 का उपयोग करता है. यह प्रोटीन विकृतीकरण में यह परिणाम है और इस प्रकार chromatin संरचना के विनाश का कारण बनता है जो डीएनए की (हाइपोक्लोरस एसिड का उपयोग) एसिड hydrolysis शामिल है. वैकल्पिक रूप से, महिला meiocytes और gametophytic कोशिकाओं में गुणसूत्र संगठन (उदाहरण के लिए 14-18 देखें) अर्द्ध पतली वर्गों या विच्छेदित भ्रूण थैलियों और एमएमसी पर DAPI धुंधला और immunostaining का उपयोग कर देखा जा सकता है. जाहिर है, हालांकि, पुस्तिका विच्छेदन और सेक्शनिंग श्रम गहन हो सकता है और कर सकते हैंchromatin epitopes की एक बड़ी संख्या के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण पर बाधा उत्पन्न करती है.
यहाँ हम पूरे माउंट में नीचे की ओर कोशिकाविज्ञान धुंधला की एक किस्म के लिए उपयुक्त एराबिडोप्सिस बीजाणु की एक बड़ी संख्या को तैयार करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. संक्षेप में, फूल कलियों एक लगानेवाला समाधान में incubated हैं, बीजाणु की पंक्तियों कापेल से विच्छेदित कर रहे हैं और पराग meiocytes 19,20 के लिए किया जाता के रूप में स्लाइड पर acrylamide में एम्बेडेड. एम्बेडेड बीजाणु आगे मेथनॉल, इथेनॉल, और सेल दीवार पाचन और permeabilization पहले xylene में मंजूरी दे दी है और तय कर रहे हैं. इन कदमों से संभव रूपांतरों चर्चा कर रहे हैं. नमूने तो डीएनए धुंधला हो जाना, immunostaining, और मछली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तैयारी मोड कुशल है और (अप करने के लिए 16 स्लाइड्स अलग बहाव के विश्लेषण के लिए एक दिन में तैयार किया जा सकता है) समानांतर प्रयोगात्मक सेट अप के लिए अनुमति देता है. वर्णित उपचार, पूरे माउंट में सजातीय संकेतों सक्षम और अच्छी तरह से ऊतकीय, सेलुलर संरक्षितऔर प्रकार की कोशिकाओं के बीच गुणात्मक और मात्रात्मक तुलना लाभ जो प्रजनन कोशिकाओं और आसपास के nucellar कोशिकाओं में परमाणु संगठन. कैलिब्रेटेड, 3 आयामी पुनर्निर्माण द्वारा पीछा CLSM आधारित उच्च संकल्प इमेजिंग फ्लोरोसेंट संकेतों के सार्थक मात्रात्मक माप सक्षम बनाता है. हम सफलतापूर्वक फर्क एमएमसी 21 और महिला gametophyte 22 को विकसित करने में chromatin गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस प्रक्रिया का इस्तेमाल किया; हम यहाँ पूरे माउंट बीजाणु में हेट्रोक्रोमैटिन विश्लेषण, chromatin immunostaining, GFP immunostaining और मछली के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं. हम आगे हमारे प्रोटोकॉल अन्य संयंत्र के ऊतकों और प्रजातियों के लिए उपयुक्त हो जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
फूल पौधों में, महिला प्रजनन वंश इस तरह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पूरे माउंट में कोशिकीय धुंधला प्रतिपादन, nucellus और बीजांड teguments सहित कई सेल परतों से घिरा हुआ है. यहाँ हम इस तरह पूरे माउंट में स्वस्थानी स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ueli Grossniklaus (University of Zürich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Zürich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C) | ||
| 200mL 5% acrylamide mix in PBS | 34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. . An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al. Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. 유전학. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). 유전학. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. . Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
