In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Summary

Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden.

Abstract

Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduction

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine von einer großen Sammlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Tauopathien bekannt. Die Quintessenz der zugrunde liegenden Pathologie Tauopathie um die Neurofibrillen, NFTs, in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia ^1-4. Die NFT Dichte korreliert mit kognitiver Beeinträchtigung ^3,5 und Verlust von Nervenzellen ^6. NFT enthält in erster Linie hyperphosphoryliertem Tau-Protein (im Folgenden als "p-tau" fortan genannt), die direkt oder gepaarten helikalen Filamenten (PHF) ^7,8 bildet. Tau ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein vermutlich axonalen Transport, die für neuronale Signalübertragung und den Handel ^9,10 ist zu erleichtern. Jedes tau Molekül 2-3 Phosphate im normalen Gehirn, sondern die Phosphoryl-Gehalt steigt um mehrere Falten in Tauopathie Patienten ^11. Mehrere Kinasen sind wahrscheinlich zu Tau-Hyperphosphorylierung beitragen einschließlich GSK3 & bgr; (Glykogensynthasekinase 3β) und CDK5 (cyclin-dehängig Kinase 5) ^12,13, aber der direkte Auslöser für die pathologischen Phosphorylierung weiter Ferne ^14. Abnormalen Phosphorylierung in oder in der Nähe der Mikrotubulus-Bindungsmotive distanziert tau vom Filament ^15, und bewirkt tau Fehllokalisierung zu der somatodendritischen Faches, p-tau oligomerisiert in gerader oder gepaarte helikale Filamente, die schließlich in NFT Einschlüsse polymerisieren kann. Die enge Verbindung zwischen Tau-Hyperphosphorylierung, NFT-Bildung und Neurodegeneration zu einer vorherrschenden Annahme, dass p-tau Tangles hervorrufen apoptotischen und andere zytotoxische Reaktionen, und damit ist die zugrunde liegende Ursache für Tauopathie Neurodegeneration ^16,17. Drogen-Bildschirme und frühen klinischen Tests, die auf dieser Prämisse wurden eingeleitet ^18. , Gibt es bei diesem Hypothese Herausforderungen ^19,20. Zum Beispiel Santacruz et al. Zeigten, dass die kognitiven Funktionen von transgenen Mäusen kann durch Unterdrücken der Expression eines mutierten verbessernhumanem tau, obwohl NFTs weiterhin von bestehenden tau Moleküle ²¹ bilden. In einem Drosophila Modell NFT wurde gezeigt, dass die toxische zytosolische Tau-Sequestrierung, die zugrunde liegenden Nervenzellen ^22,23 schützen. Offensichtlich ist die Pathogenese Rolle NFT, falls vorhanden, stark beeinflussen die Richtung Tauopathie Therapeutika Entwicklung.

In hohen Konzentrationen rekombinanten oder normale Gehirn tau Protein spontan, sondern langsam polymerisiert in ein PHF-ähnliche Struktur in vitro, wie durch die Bindung mehrerer β-Faltblatt bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffe, elektronenmikroskopischen und Lichtstreuungsspektroskopie ^24-27 angegeben. Hinzufügen von Heparin oder Arachidonsäure, eine reichliche Fettsäuren im menschlichen Gehirn, drastisch beschleunigt PHF-Bildung in tau isoform- und Induktor konzentrationsabhängigen Weise ^28-32. Interessanterweise hyperphosphoryliertem tau gereinigt von AD-Gehirnen oder vollständig in vitro Phosphorylierungsreaktionen a vorbereitetggregates schneller und effizienter ^26,33-35. Diese Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit der pathologischen Rolle von p-tau. Ein in vitro-System auf der Grundlage der Aggregation von p-tau kann somit als ein leistungsfähiges Werkzeug für AD Wirkstoff-Screening dienen.

Angesichts der engen Verbindung zwischen Tau-Aggregation und die fortschreitende Neurodegeneration von AD, sowie die letzten Fehler in der Medikamentenentwicklung zur Förderung der Aß-Plaques eine andere Taste histologische Marker der AD ^36-38, das Interesse an der Entdeckung Drogen, die steuern, Tau-Aggregation steigt. In der Tat, einige Gruppen haben bereits Drogen-Bildschirme mit unterschiedlichen Durch begonnen, mit In-vitro-Tau-Aggregation Reaktionen als primäre Assay. Eine Reihe von Chemikalien wurden als hemmend oder Umkehrung Aktivitäten auf Tau-Aggregation in vitro ^39-42 aufweisen. Allerdings werden alle aktuellen Tau-Aggregation Regler Bildschirme verwenden unmodifizierten tau, die den Schlüssel pathologischen Kennzeichen Phosphor vermisstlierung und hob eine Sorge um die Spezifität und Wirksamkeit der Verwendung dieser Verbindungen bei AD-Behandlung.

Eines der Haupthindernisse für die Entwicklung Aggregationsassays zur biochemischen Charakterisierung und AD Wirkstoff-Screening ist die Herstellung von ausreichenden Mengen des pathophysiologisch relevanten hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Verwendung des Zippers Assisted Catalysis System, in dem die 1N4R Isoform von tau und der GSK-3β-Kinase in E. coexprimiert coli als Leucin-Zipper-Fusionsproteine, haben wir diese Herausforderung zu meistern (. Sui et al, eingereicht; siehe Abbildung 1 für die Endprodukte von Tau und p-tau; siehe auch ⁴³ Vorab Massenspektrometrie Charakterisierung von p-tau). Aus einem Panel von für unterschiedliche Phosphorylierungsstellen von Tau neun Antikörper wurden positive Signale in acht Positionen gesehen (Daten nicht gezeigt). Im Folgenden beschreiben wir, Protokolle und Besetzungen, die die Aggregation kinetische d unterscheiden kannifferences zwischen unmodifizierten tau und p-tau-Arten. Diese Assays wurden aus veröffentlichten Protokollen, die den Anstieg der Fluoreszenz von Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) auf Amyloid (tau Aggregate) Bindung ²⁶ gemessen modifiziert. In der ersten "Endgerät", keine Farbstoffansatz Aggregationsreaktionen werden zusammengebaut und in der Abwesenheit des Amyloid-Farbstoff inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird ein Aliquot jeder Reaktion entnommen und mit einem gleichen Volumen des ThT-haltigen Puffer gemischt, um eine Aggregation schalten und THT tau Aggregate binden. Fluoreszenz wird von einem IAP FluoroMax-2-Fluorometer gemessen. In der zweiten "mit Farbstoff" kontinuierliche Überwachung Assay ThT oder ThS in den Aggregationsreaktionen enthalten. Fluoreszenz kann kontinuierlich während des gesamten Experiments manuell oder unter Verwendung eines Mehrplatten-Lesegeräts gemessen werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen Test, der eine nahezu physiologische Konzentration von Tau und p-tau für die Aggregation in der kontinuierlichen Messung mo verwendetde. Die Wirkung der Phosphorylierung bleibt leicht nachweisbar. Im Folgenden werden wir Schritt-für-Schritt-Betrieb wird beschrieben, und zeigen repräsentative Ergebnisse dieser Tests. Diskussion über einige der Vor-und Nachteile der einzelnen Ansätze sowie potenzielle Wirkstoff-Screening-Anwendungen werden folgen.

In einer hohen Konzentration, aggregiert tau amyloidartigen Strukturen spontan. Jedoch im Labor tau Fibrillenbildung wird typischerweise durch solche Induktoren wie Heparin (mittleres Molekulargewicht 6000 g / mol) und Arachidonsäure beschleunigt. Beispiele hier gezeigten sind 30 uM Heparin. Die Bildung von Tau Amyloidaggregaten durch die Fluoreszenz von Amyloid-Bindung durch Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) resultierenden überwacht. Nach Bindung an Tau-Aggregaten weist ThT eine Rotverschiebung der Fluoreszenz (Anregung: 450 nm; Spitzenemission: 485 nm). ThS andererseits eine schwache Emission bei 510 nm (Anregung bei 450 nm) vor Amyloid-Bindung, aber dies fluorescence steigt signifikant in Gegenwart eines Amyloid Protein wie das aggregierte tau ^44. Beide Farbstoffe funktionieren gut bei der Aufdeckung von Tau und p-Tau-Aggregation. Aufgrund des starken und relativ breite Emissionsspitze von ThT (siehe Abbildung 2), gibt es nur 30% ige Reduktion der Fluoreszenz-Einheit bei 510 nm. Der Bequemlichkeit halber verwenden wir die gleiche Kombination von Anregungs- / Emissionswellenlängen (das heißt, 450 nm / 510 nm), um Tau-Aggregation zu überwachen, wenn entweder Farbstoff.

Tau-Aggregation kann in Gegenwart oder Abwesenheit des Farbstoffs durchgeführt werden, abhängig von dem Zweck des Tests und Verfügbarkeit der Tau-Protein. Beide Arten der Reaktionen sind unten dargestellt. Darüber hinaus zeigen wir, den Betrieb von zwei verschiedenen Instrumenten – eine Einzelprobe Fluorometer (ISA-SPEX FluoroMax-2) und eine Multi-Plattenlesegerät (SpectraMax M2). Die Leser sollten in der Lage, diese Protokolle anzupassen, um ihre spezifischen Bedürfnisse und Verfügbarkeit Instrument zu entsprechen.

Protocol

1. Vorbereitung der Reagenzien Bereiten Aggregationspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Lagern Sie bei RT, über Monate stabil. Supplement 1 mM Dithiothreitol (DTT) vor dem Gebrauch. HINWEIS: a HEPES-basierten Puffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) erzeugt auch ähnliche Ergebnisse in Tau-Aggregation. Bereiten Thioflavin T oder Thioflavin S-Stammlösung (3 mM, in Aggregationspuffer) und Filter von 0,22 um sterile Filtereinheit. Bei -20 ° C in einem Röhrchen mit…

Representative Results

Unter Verwendung rekombinanter tau und p-tau (Abbildung 1), haben wir zwei verschiedene Protokolle, die Kinetik der Aggregation von Tau und p-tau zu vergleichen, unter Ausnutzung der starken Fluoreszenzemission ThT THS bei Bindung an amyloide Protein-Aggregate, einschließlich tau und p-tau (Abbildung 2). Mit oder ohne dem Fluoreszenzfarbstoff in der Aggregationsreaktion beobachteten wir konsequente Weiterentwicklung der Tau-Aggregation durch Hyperphosphorylierung (Figuren 3-5)….

Discussion

Dieses Protokoll zeigt unterschiedliche Assaybedingungen und Instrumente, die phosphorylierungsabhängige schnell tau Aggregationskinetik erkennen. Im Terminal Assay wird der Fluoreszenzfarbstoff ThT zu einem Teil der Reaktionsmischung aus dem Master zu jedem Zeitpunkt entfernt, hinzugefügt. Amyloid-bindende-induzierte Fluoreszenz wird gemessen ^26. In der zweiten, mit Farbstoff Modus Tau-Aggregation in Gegenwart von ThT oder ThS geführt, wodurch diese Art von Reaktion geeignet für automatischen Echtzeit-Be…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4°C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80°