Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas
Summary
Ratiometric balizas bimoleculares (RBMBs) se pueden utilizar para los transcritos de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega de RBMBs en las células mediante formación de microporos y la imagen fluorescente de transcritos de ARN individuales en tiempo real.
Abstract
La creciente conciencia de que tanto la regulación temporal y espacial de la expresión génica puede tener consecuencias importantes sobre la función celular ha llevado al desarrollo de diversas técnicas para visualizar las transcripciones de ARN individuales en células vivas individuales. Una técnica prometedora que ha sido recientemente descrito utiliza una sonda de oligonucleótidos basados en óptica, radiométrica faro bimolecular (rbmb), para detectar transcritos de ARN que fueron diseñados para contener al menos cuatro repeticiones en tándem de la secuencia diana rbmb en la región 3 'no traducida. RBMBs están específicamente diseñados para emitir una señal fluorescente brillante tras la hibridación con ARN complementario, pero por lo demás permanecen apagados. El uso de una sonda sintética en este enfoque permite fotoestable, desplazada al rojo, y colorantes orgánicos altamente emisivo para ser utilizado para la imagen. La unión de múltiples RBMBs a las transcripciones de ARN de ingeniería resultados en puntos discretos de fluorescencia cuando se observa bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio. En consecuencia, el movimiento de transcritos de ARN individuales puede ser visualizado fácilmente en tiempo real mediante la adopción de una serie temporal de imágenes fluorescentes. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega en las células mediante formación de microporos y vivimos de células de formación de imágenes de transcritos de ARN individuales.
Introduction
La expresión y la regulación de las transcripciones de ARN es un proceso complejo y dinámico que es en gran parte responsable de controlar el comportamiento de las células y el destino. Aunque la importancia de ARN en función de la célula dictando ha sido conocido durante algún tiempo, a menudo es difícil establecer conexiones claras entre los dos ya que la mayoría de las herramientas de análisis de ARN carecen de la resolución espacial y temporal requerida para capturar eventos regulatorios importantes, tales como rotura de la transcripción, ARN el tráfico y el procesamiento del ARN localizada. Esto ha llevado a la llegada de varias técnicas que permiten transcritos de ARN individuales para ser visualizados en las células vivas en tiempo real 1. Quizás, la más prominente de estas técnicas utiliza una proteína de fusión GFP-MS2 al ARN diana que ha sido diseñado para contener repeticiones en tándem del sitio de unión MS2 en la 3'-UTR 2,3. Al reunir múltiples moléculas GFP en estrecha proximidad, transcripciones de ARN individuales aparecen como puntos fluorescentes brillantesa través de microscopía de fluorescencia. El sistema de GFP-MS2 ha proporcionado una visión sin precedentes sobre el comportamiento de ARN, incluyendo la visualización directa y la medición de la transcripción de ruptura de 4,5, la detección de la única localización y procesamiento 6-9 subcelular, y de imágenes en tiempo real del transporte de ARN 10. Sin embargo, a pesar del enorme potencial del sistema de GFP-MS2, proteínas de fusión GFP-MS2 no unidos pueden crear una señal fluorescente de alta de fondo que limita la flexibilidad y el rango dinámico de esta técnica. Se han desarrollado varios enfoques para limitar esta señal de fondo, incluyendo la compartimentación subcelular de GFP no unido MS2-10, proteína de fragmento de complementación 11, y las proteínas de unión de ARN alternativos y objetivos 12. Sin embargo, todos estos enfoques siguen siendo sensibles a la expresión relativa y total de la diana de ARN y la proteína de fusión GFP-MS2.
Como unaLTERNATIVA a los sistemas de GFP-MS2, balizas moleculares se han utilizado también para detectar transcritos de ARN de ingeniería con repeticiones en tándem del sitio de unión complementario en la 3'-UTR 13,14. Las balizas moleculares son sondas de oligonucleótidos de formación de horquilla que están etiquetados en un extremo con un extintor y en el otro extremo con un indicador fluorescente. Cuando no unido a ARN diana el reportero fluorescente y desactivador permanecer en estrecha proximidad, dando como resultado un estado de baja fluorescente. Tras la hibridación, el indicador fluorescente y el extintor se ven forzadas a separarse y la fluorescencia se restaura. Similar al sistema de GFP-MS2, la unión de múltiples balizas moleculares en un único transcrito de ARN resultados en una mancha fluorescente brillante que se puede identificar mediante microscopía de fluorescencia; Sin embargo, se espera que la fluorescencia de fondo a ser mucho menor, debido a la configuración de no unidos se inactivó balizas moleculares. Desafortunadamente, a pesar del mecanismo de activación inteligente que se incorpora en el mdiseño de baliza olecular, ahora hay evidencia creciente de que las balizas moleculares no hibridadas no permanecen en la conformación de horquilla cuando se introduce en las células vivas. En consecuencia, se generan una señal de falso positivo que reduce significativamente la relación señal a fondo. Para superar este inconveniente, recientemente hemos desarrollado una nueva sonda sintética de ARN de imágenes en las células vivas, ratiometric balizas bimolecular (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs se componen de dos cadenas de oligonucleótidos 2'-O-metilo que forman una estructura híbrida con características tanto de ARN de horquilla corta (ARNhc) y balizas moleculares. El mecanismo de bucle y la activación de fluorescencia es similar a la baliza molecular, mientras que el largo dominio de doble cadena con un saliente 3 'UU es más característico de shRNA. Las características shRNA están diseñados para impulsar las exportaciones nucleares, lo que hemos encontrado incrementos vida intracelular a> 24 h, con la degradación observable mínimo, yimpide la apertura no específica del bucle. Como resultado RBMBs exhiben un fondo señal-significativamente mayor que las balizas moleculares.
Cabe señalar que RBMBs no se puede preparar utilizando oligonucleótidos de ADN, ya que las sondas basadas en el ADN no poseen las mismas capacidades de exportación nuclear como sondas basados en ARN. Estructuralmente, el bucle rbmb está típicamente diseñado para ser entre 15 y 21 bases de longitud, para crear un equilibrio entre la especificidad y la selectividad al ARN hibridación. El tallo corto que se forma a partir de los dos dominios de auto-complementarias está generalmente diseñado para ser 4 bases. Si se selecciona un vástago más largo, la velocidad de hibridación entre el bucle rbmb y ARN diana se ralentiza significativamente 17,18. Por el contrario, cuando se selecciona una secuencia de tallo más corto la temperatura de fusión es a menudo demasiado bajo para sostener la estructura de tallo-bucle a 37 ° C, dando lugar a una señal de fondo. La especificidad de la rbmb también es de color rojouced como la longitud del tallo se acorta. Dado que la secuencia de la rbmb tallo-bucle también puede influir en el rendimiento rbmb, debe ser cuidadosamente seleccionado 19. En particular, las secuencias de bucle ideales deben tener un mínimo de estructura secundaria, se hibridan con las secuencias de ARN con estructura secundaria mínimo, evitar los sitios de unión a proteínas, y evitar fuera de objetivo vinculante. Las predicciones de tanto rbmb y la estructura secundaria del ARN se pueden obtener usando software tal como mfold 20. Complementarias sitios fuera de objetivo pueden identificarse utilizando un nucleótido Basic Local herramienta para asignación de Búsqueda (BLAST). Sin embargo, debido a las inconsistencias en las predicciones del modelo y la dificultad en la identificación de los sitios de proteínas de presagiar, la especificidad de todos RBMBs última instancia, debe ser validada experimentalmente.
Si se desea, un colorante de referencia unquenched que es insensible al estado de hibridación puede ser añadido a la rbmb 15. La adición de un colorante de referencia puede prOvide un marcador para la entrega de la sonda y se utiliza para la imagen radiométrica, si se requieren mediciones más precisas de la fluorescencia celular total. Los tintes de referencia permite realizar mediciones ajustadas a los diferentes antecedentes, debido a las variaciones de célula a célula en la entrega. Sin embargo, cuando la formación de imágenes individuales de ARN transcripciones del colorante de referencia no es necesario. En particular, algunos de los colorantes de referencia pueden interferir con la exportación de RBMBs desde el núcleo, dando lugar a una señal de fondo ligeramente más alto en el núcleo.
Cuando se diseñan adecuadamente, RBMBs se pueden utilizar para imagen transcritos de ARN individuo en células vivas, si el ARN diana está diseñado para contener al menos cuatro sitios de unión rbmb (Figura 1B) 16. RBMBs pueden ser entregados de manera eficiente en una amplia gama de tipos de células a través de microporos, con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular 21, y las mediciones cuantitativas de la expresión génica puedeadquirida en los 30 minutos. Por otra parte, la metodología es bastante insensible a niveles de concentración rbmb y ARN diana, ya que la fluorescencia de RBMBs no unidos se apaga de manera eficiente. Aquí le ofrecemos una descripción detallada de la metodología utilizada para preparar y purificar RBMBs, así como un procedimiento general para la entrega de RBMBs en células vivas a través de microporos y la imagen de las transcripciones de ARN individuales en tiempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de las transcripciones de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas usando un microscopio de campo amplio convencional requiere una señal fluorescente brillante y fotoestable de estar asociado con cada una transcripción de ARN y un fondo fluorescente bajo que emana de sondas fluorescentes no unidos. En este método, una señal fluorescente brillante se logra mediante la hibridación de múltiples (hasta 96) sondas fluorescentes basados en oligonucleótidos, es decir, RBMB…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia Premio CARRERA (0953583) y el Instituto Nacional de Salud NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
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