Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons
Summary
Ratiometrisk bimolekylära fyrar (RBMBs) kan användas för att avbilda enskilda manipulerade RNA-transkript i levande celler. Här beskriver vi framställning och rening av RBMBs, leverans av RBMBs in i celler genom mikroporation och fluorescerande avbildning av enstaka RNA-transkript i realtid.
Abstract
Den växande insikten att både tidsmässiga och rumsliga reglering av genuttryck kan få betydande konsekvenser på cellfunktionen har lett till utvecklingen av olika tekniker för att visualisera enskilda RNA-transkript i enskilda levande celler. En lovande teknik som nyligen har beskrivits utnyttjar en oligonukleotid-baserad optisk sond, ratiometrisk bimolekylär beacon (RBMB), för att detektera RNA-transkript som var konstruerade för att innehålla åtminstone fyra tandemupprepningar av den RBMB målsekvens i den 3'-otranslaterade regionen. RBMBs är särskilt utformade för att avge ett klart fluorescerande signal vid hybridisering till komplementärt RNA, men annars förblir släcktes. Användningen av en syntetisk sond i detta tillvägagångssätt tillåter fotostabila, rödskiftade och starkt emissiva organiska färgämnen som skall användas för bildframställning. Bindning av flera RBMBs till de manipulerade RNA-transkript ger diskreta fluorescens fläckar när den visas med ett brett fält fluorescerande mikroskop. Följaktligen kan rörelsen hos enskilda RNA-transkripten lätt visualiseras i realtid genom att ta en tidsserie av fluorescerande bilder. Här beskriver vi framställning och rening av RBMBs, leverans i celler genom mikroporation och live-cell imaging av enstaka RNA-transkript.
Introduction
Uttrycket och regleringen av RNA-transkript är en komplex och dynamisk process som är till stor del ansvarig för att kontrollera cellens beteende och öde. Även betydelsen av RNA i diktera cellfunktionen har varit känt under en längre tid är det ofta svårt att dra tydliga kopplingar mellan de två eftersom de flesta RNA analysverktyg saknar rumslig och tidsmässig upplösning som krävs för att fånga viktiga reglerings händelser såsom transkriptions spricker, RNA människohandel, och lokal RNA bearbetning. Detta har lett till tillkomsten av flera tekniker som gör att enskilda RNA-transkript som ska visualiseras i levande celler i realtid 1. Kanske den mest framträdande av dessa tekniker använder en GFP-MS2 fusionsprotein för att rikta RNA som har konstruerats för att innehålla tandemupprepningar av MS2 bindningsställe i 3'-UTR 2,3. Genom att flera GFP molekyler i närheten, enskilda RNA-transkript visas som ljusa fluorescerande fläckarvia fluorescensmikroskopi. GFP-MS2-systemet har gett helt nya kunskaper om RNA beteende, inklusive direkt visualisering och mätningar av transkriptions spricker 4,5, upptäckt av unika under cellulär lokalisering och behandling 6-9, och i realtid avbildning av RNA transport 10. Men trots den enorma potentialen av GFP-MS2-systemet, kan obundna GFP-MS2-fusionsproteiner skapar en hög bakgrund fluorescerande signal som begränsar mångsidigheten och dynamiska området för denna teknik. Flera tillvägagångssätt har utvecklats för att begränsa denna bakgrundssignal, inklusive subcellulära uppdelning av obundna GFP-MS2 10, proteinfragmentkompletterings 11, och alternativa RNA-bindande proteiner och mål 12. Emellertid är alla dessa metoder förblir känsligt för den relativa och totala expressionen av RNA-målet och GFP-MS2-fusionsprotein.
Som ettlternative till de GFP-MS2-system, har molekylfyrar också använts för att detektera manipulerade RNA-transkript med tandemupprepningar av den komplementära bindningsställe i 3'-UTR 13,14. Molecular beacons är hårnålsbildande oligonukleotidsonder som är märkta i ena änden med en quencher och vid den andra änden med en fluorescerande reporter. När den inte skyldig att rikta RNA den fluorescerande reporter och släcknings kvar i närheten, vilket resulterar i en låg fluorescerande tillstånd. Efter hybridisering, är den fluorescerande reporter och utsläckare tvingas isär och fluorescensen är återställd. I likhet med den GFP-MS2-systemet, bindningen av multipla molekylära fyrar på ett enda RNA-transkript resulterar i en klart fluorescerande fläck som kan identifieras genom fluorescensmikroskopi; dock bakgrundsfluorescensen väntas bli mycket lägre, på grund av den kylda konfigurationen av obundna molekylära fyrar. Tyvärr, trots aktiveringsmekanismen smart som är införlivat med molecular fyr design, finns det nu alltfler tecken som ohybridiserad molekylära fyrar inte kvar i hårnålen konforma när den införs i levande celler. Följaktligen genererar de en falskt positiv signal, som väsentligt minskar signal-till-bakgrund. För att övervinna denna brist, nyligen utvecklade vi en ny syntetisk sond för avbildning RNA i levande celler, ratiometrisk bimolekylära fyrar (RBMBs; Figur 1A) 15,16. RBMBs består av två 2'-O-metyl oligonukleotidsträngar som bildar en hybridstruktur med funktioner från både korta hårnål RNA (shRNA) och molekylära fyrar. Slingan och fluorescens aktiveringsmekanismen liknar den molekylära fyr, medan den långa dubbelsträngat domän med en 3'-UU hänget är mer kännetecknande för shRNA. De shRNA funktioner är utformade för att driva kärn export, som vi har funnit ökar intracellulär livstid att> 24 timmar, med minimal observerbar nedbrytning ochförhindrar ospecifik öppning av slingan. Som ett resultat RBMBs uppvisar en signifikant högre signal-till-bakgrund än molekylära fyrar.
Det bör noteras att RBMBs inte kan framställas med användning av DNA-oligonukleotider, eftersom DNA-baserade prober besitter inte samma nukleära exportkapacitet som RNA-baserade prober. Strukturellt är RBMB slingan normalt konstruerade för att vara mellan 15 och 21 baser långa, för att skapa en balans mellan specificitet och selektivitet vid RNA hybridisering. Den kort rör som bildas av de två själv komplementära domäner brukar utformad för att vara fyra baser. Om ett längre skaft väljs hybridiseringshastigheten mellan RBMB slingan och mål-RNA markant avtagit 17,18. Omvänt smälttemperaturen är ofta när en kortare stam sekvens väljs alltför låg för att upprätthålla den stam-slingstruktur vid 37 ° C, vilket leder till en hög bakgrundssignal. Specificiteten av RBMB är också röduced som skaftlängden förkortas. Eftersom sekvensen av den RBMB stam-ögla kan också påverka RBMB prestanda måste den noggrant utvalda 19. I synnerhet bör ideala slingsekvenser har minimal sekundärstruktur, hybridisera till RNA-sekvenser med minimal sekundärstruktur, undvik proteinbindningsställen, och undvika off-target bindande. Förutsägelser av både RBMB och RNA-sekundärstruktur kan erhållas med användning av programvara såsom mfold 20. Kompletterande ej åsyftade platser kan identifieras med hjälp av en nukleotid Basic Local Uppdrag Sökverktyg (BLAST). Men på grund av inkonsekvenser i modellprognoser och svårigheten att identifiera protein bidar platser, specificitet alla RBMBs måste slutligen valideras experimentellt.
Om önskvärt, kan ett odämpat referens färgämne som är okänslig för hybridiseringen tillstånd sättas till RBMB 15. Tillägget av en referensfärg kan prOvide en markör för sond leverans och användas för ratiometrisk avbildning, om mer exakta mätningar av total cellulär fluorescens krävs. Referens färgämnen gör mätningar justeras för skillnader i bakgrunden på grund av cell till cell variationer i leveransen. Men när avbildning individuell RNA-transkriptioner referens färgämnet är inte nödvändigt. Noterbart kan några referens färgämnen störa exporten av RBMBs från kärnan, vilket leder till en något högre bakgrundssignal i kärnan.
När utformade på rätt sätt, kan RBMBs användas för att avbilda enskilda RNA-transkript i enskilda levande celler, om mål-RNA är konstruerad för att innehålla minst fyra RBMB bindningsställen (Figur 1B) 16. RBMBs effektivt kan levereras i en rad olika celltyper via mikroporation, med liten eller ingen effekt på cellviabilitet 21, och kvantitativa mätningar av genuttryck kan varaförvärvats inom 30 min. Dessutom är metoden relativt okänslig för RBMB koncentration och mål-RNA-nivåer, eftersom fluorescens från obundna RBMBs effektivt släckes. Här ger vi en detaljerad beskrivning av den metod som används för att förbereda och rena RBMBs, samt ett allmänt förfarande för leverans av RBMBs in i levande-celler via mikroporation och avbildning av enstaka RNA-transkript i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förmågan att bildenkel manipulerade RNA-transkript i levande celler med användning av en konventionell brett fält mikroskop kräver en ljus och fotostabil fluorescerande signal som skall associeras med varje RNA-transkript och en låg fluorescerande bakgrund som härrör från obundna fluorescerande prober. I denna metod, är en ljus fluorescerande signal uppnås genom hybridisering av multipla (upp till 96) oligo-baserade fluorescerande prober, dvs RBMBs, på varje RNA-transkript. Emellertid så få som fy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Science Foundation KARRIÄR Award (0953583) och National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
