Aip1p Dynamics werden von der R256H Mutation in Actin Altered
Summary
Krankheitsverursachende Mutationen in Aktin-Zytoskelett-Funktion kann zu verändern. Cytoskeletal Dynamik werden durch Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Proteinen unter Verwendung von internen Totalfluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Als Beispiel hat die Zytoskelett-Protein, Aip1p, Lokalisierung und Bewegung in Zellen, die das mutierte Aktin-Isoform exprimieren, R256H verändert.
Abstract
Mutationen in Aktin verursachen eine Reihe von Krankheiten des Menschen durch spezifische molekulare Veränderungen, die oft ändern Zytoskelett-Funktion. In dieser Studie Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Proteinen unter Verwendung interner Total Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie wird verwendet, um Veränderungen im Zytoskelett-Dynamik zu visualisieren und zu quantifizieren. TIRF-Mikroskopie und die Verwendung von fluoreszierenden Markierungen ermöglicht auch eine Quantifizierung der Änderungen Zytoskeletts durch Mutationen in Aktin verursacht. Unter Verwendung dieser Technik Quantifizierung der Zytoskelett-Funktion in lebenden Zellen wertvoll ergänzt in vitro-Studien der Proteinfunktion. Als Beispiel wurden Missense-Mutationen, die die Aktin-Rest R256 in drei menschlichen Actin-Isoformen hindeutet diese Aminosäure eine wichtige Rolle in regulatorischen Wechselwirkungen identifiziert. Die Wirkungen von Aktin R256H-Mutation auf Zytoskelett Bewegungen wurden unter Verwendung des Hefe-Modell untersucht. Das Protein, AIP1, die bekannt ist, Cofilin in Aktin Depolymerisation zu unterstützen, warmit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert am N-Terminus und in vivo unter Verwendung von TIRF-Mikroskopie verfolgt. Die Rate der Aip1p Bewegung sowohl in Wildtyp-und Mutanten-Stämme wurde quantifiziert. In Zellen R256H-Mutante Aktin exprimieren, ist Aip1p Bewegung eingeschränkt und die Geschwindigkeit der Bewegung ist fast die Hälfte der Geschwindigkeit gemessen in Wildtyp-Zellen (0,88 ± 0,30 um / s in R256H-Zellen im Vergleich zu 1,60 ± 0,42 um / s in Wildtyp-Zellen, S. <0,005).
Introduction
Aktin ist der Hauptprotein, das das Zellskelett und beteiligt sich an kritische zelluläre Prozesse einschließlich Zellteilung, Organellen Bewegung, Zellbewegung, Kontraktion und Signalisierung. Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben krankheitsverursachende Mutationen in Aktin in jeder der sechs menschlichen Actin-Isoformen, die zu einer Reihe von Erkrankungen entdeckt worden, von Myopathien Koronararterienerkrankung 1-7. Die Prozesse, durch die Aktin Mutationen führen zu Krankheit weiter erläutert. Die Hefe-Modell bleibt der Goldstandard, um die biochemischen Auswirkungen von Mutationen auf die Aktin-Funktion aufgrund der Vorteile des Binnen wesentliche Aktin-Isoform, genetische Lenkbarkeit und hohe Erhaltung der Aktin-Sequenz und Funktion zu untersuchen. Studien zeigen, dass einzelne Aktin-Mutationen führen zu spezifischen molekularen Funktionsstörungen mit dominant negative Effekte 8. Zum Beispiel, Taubheit verursachenden Mutationen in γ-Nicht-Muskel-Aktin, die die Lys-118-Rest beeinflussen verändern Regulierung durchdas Aktin-bindende Protein Arp2 / 3 9. Studien häufig in vitro-Analysen beschäftigen Protein-Protein-Interaktionen. Untersuchungen über die Wirkung der Mutationen auf Aktin Zellbiologie und insbesondere Aktin-Bindeproteinlokalisierung in der Zelle begrenzt.
Studien der Hefe Zytoskeletts in vivo konventionell verlassen sich auf Bilder von fixierten Zellen von einem invertierten Fluoreszenzmikroskop 10. Diese Experimente geliefert grundlegende Daten über die Morphologie des Actin-Cytoskeletts. Untersuchungen haben seit dreidimensionalen konfokalen Abbildungs eingebaut, um die komplexen Zytoskelett-Netzwerk 11, 12 sichtbar. Dieses bildgebende ermöglicht die Quantifizierung der Fülle und der relativen Lage der Aktin-Filamente und Patches. Dünnelektronentomographie hat zu Bild verwendet wurde die Morphologie der dichten Fadennetze relativ zu erhalten subzellulärer Strukturen 13. Crowded zellulären sSchritte mit einem kleinen Querschnitt kann in feinen Details mit dieser Technik untersucht werden. Imaging-Studien haben lebende Zellen mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie erweitert. Als Bleich Foto-und Hintergrundfluoreszenz moderiert werden, ermöglicht Zeitraffer-Imaging Untersuchungen der Dynamik der Proteine des Zytoskeletts und der Reaktion auf Umweltbedingungen 11, 14. Getrennt davon wurde die Visualisierung der Dynamik von Aktin-Filamenten in vitro durch die Einführung von Total-Innenreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie schoben. Im Vergleich zu Weitfeld-Mikroskopie, TIRF hat den Vorteil der verringerten Hintergrundfluoreszenz und verbesserte Kontrast zu einzelnen Fäden 15, 16 zu überwachen. Mit diesen Eigenschaften ist TIRFM Zellbiologen angepasst worden, um Zellstrukturen an der Plasmamembran 17, 18 zu überwachen. Cellular Ereignisse, einschließlich der Änderungen im Zytoskelett, kannEchtzeit mit niedrigen Phototoxizität, maximaler Kontrast und minimaler Hintergrundfluoreszenz 19 visualisiert werden.
Um die Wirkung der Mutationen auf die Aktin-Bewegung, Lokalisierung und Umsatz von Zytoskelett-Proteine in der Zelle, TIRF-Mikroskopie und Proteinmarkierungs besseren Verständnis verwendet. Hierin sind Verfahren, um die Auswirkungen einer klinisch relevanten Mutation in Aktin auf Zytoskeletts in Saccharomyces cerevisiae untersucht werden beschrieben. Insbesondere ist die Lokalisierung und Bewegung des Aktin-bindendes Protein, Aip1p wurde visualisiert und in Zellen die R256H-Mutation in Actin exprimieren quantifiziert. Diese Techniken ergänzen biochemischen in vitro Studien und ermöglichen ein besseres Verständnis der Protein-Interaktionen und Funktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine wirksame Strategie, um die Dynamik des Zytoskeletts und der Nutzen in Untersuchungen auf pathogene Mutationen visualisieren hier beschrieben wurde. Erweiterte bildgebenden Verfahren haben neue Möglichkeiten, um die intrazelluläre Bewegung von Proteinen in der Nähe der Zellmembran verstehen erstellt. Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) ist eine empfindliche Methode für funktionelle Untersuchungen in lebenden Zellen. TIRF verwendet einen abgewinkelten Anregungslaser, ein evaneszentes Feld aufgrund der D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Peter Rubenstein für nützliche Diskussion und technische Beratung und David Pellman für die ursprüngliche PB1996-Klon. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der March of Dimes und Finanzierung von der Fahrt für die Kinder unterstützt.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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