Aip1p حيوية هل غيرت من الطفرة R256H في أكتين
Summary
يمكن الطفرات المسببة للمرض في الأكتين تغيير وظيفة هيكل الخلية. وكميا ديناميات هيكل الخلية من خلال التصوير من البروتينات الموسومة fluorescently باستخدام المجهر مضان مجموع الداخلية. على سبيل المثال، البروتين هيكل الخلية، Aip1p، غيرت التعريب والحركة في الخلايا معربا عن شكل الإسوي الأكتين متحولة، R256H.
Abstract
الطفرات في الأكتين يسبب مجموعة من الأمراض التي تصيب الإنسان بسبب التغيرات الجزيئية الخاصة التي غالبا ما يغير وظيفة هيكل الخلية. في هذه الدراسة، والتصوير من البروتينات الموسومة fluorescently باستخدام مجموع مضان الداخلي (TIRF) يستخدم المجهر لتصور وقياس التغيرات في ديناميات هيكل الخلية. المجهر TIRF واستخدام العلامات الفلورية يسمح أيضا لتقدير التغيرات في ديناميات هيكل الخلية التي تسببها طفرات في أكتين. باستخدام هذه التقنية، الكمي وظيفة هيكل الخلية في الخلايا الحية يكمل قيما في الدراسات المختبرية وظيفة البروتين. كمثال على ذلك، وقد تم تحديد الطفرات مغلطة التي تؤثر على بقايا الأكتين R256 في ثلاثة الإسوية الأكتين الإنسان مما يدل على هذه الأحماض الأمينية يلعب دورا مهما في التفاعلات التنظيمية. تمت دراسة الآثار المترتبة على الطفرة R256H الأكتين على تحركات هيكل الخلية باستخدام نموذج الخميرة. كان البروتين، Aip1، والذي يعرف لمساعدة cofilin في أكتين التحلل،الموسومة مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في N-محطة وتعقبها في الجسم الحي باستخدام TIRF المجهري. وكان كميا معدل حركة Aip1p في كل نوع البرية وسلالات متحولة. في الخلايا معربا عن R256H الأكتين متحولة، ويقتصر Aip1p الحركة ومعدل الحركة ما يقرب من نصف سرعة قياسها في خلايا النوع البري (0.88 ± 0.30 ميكرون / ثانية في الخلايا R256H مقابل 1.60 ± 0.42 ميكرون / ثانية في خلايا النوع البري، ص <0.005).
Introduction
الأكتين هو البروتين السائد يضم الهيكل الخلوي وتشارك في العمليات الخلوية الحرجة بما في ذلك انقسام الخلايا، وحركة عضية، حركية الخلية، والانكماش، والإشارات. على مدى العقد الماضي، تم اكتشاف الطفرات المسببة للمرض في الأكتين في كل من الأشكال الإسوية ستة الأكتين الإنسان مما يؤدي إلى مجموعة من الاضطرابات، من الاعتلالات العضلية لمرض الشريان التاجي 1-7. مواصلة العمليات التي الطفرات الأكتين يؤدي إلى مرض إلى توضيح. يبقى نموذج الخميرة معيار الذهب لدراسة آثار الطفرات البيوكيميائية على وظيفة الأكتين بسبب المزايا التي تتمتع بها واحدة الإسوي الأكتين الأساسية، والحفاظ على قابلية الإستطراق الجينية عالية من تسلسل الأكتين وظيفة. تشير الدراسات إلى أن الطفرات أكتين الفردية يؤدي إلى الخلل الجزيئي محددة مع الآثار السلبية المهيمنة 8. على سبيل المثال، والطفرات المسببة للالصمم في أكتين γ غير العضلات التي تؤثر على بقايا ليز-118 تغيير التنظيم من قبلأكتين البروتين ملزمة Arp2 / 3 9. وكثيرا ما تستخدم الدراسات في المختبر تحليل البروتين: تفاعلات البروتين. التحقيق في تأثير الطفرات على الأكتين بيولوجيا الخلية، وبوجه خاص، أكتين البروتين التوطين الملزمة في الخلية محدودة.
دراسات الهيكل الخلوي الخميرة في الجسم الحي تعتمد تقليديا على الصور من خلايا ثابتة من مضان المجهر المقلوب 10. هذه التجارب تزويد البيانات الأساسية عن مورفولوجية الهيكل الخلوي الأكتين. التحقيقات منذ ذلك الحين أدرجت ثلاث التصوير متحد البؤر الأبعاد لتصور هيكل الخلية شبكة معقدة 11، 12. يسمح هذا التصوير الكمي وفرة، والمكان النسبي للبقع وخيوط الأكتين. وقد استخدم التصوير المقطعي رقيقة قسم الإلكترون لصورة مورفولوجية الشبكات الخيطية كثيفة النسبي للهياكل التحت خلوية الحفاظ على 13. ق الخلوية مزدحمةتسير مع شريحة صغيرة يمكن دراستها بتفصيل دقيق مع هذه التقنية. وقد تم تمديد دراسات التصوير لالخلايا الحية باستخدام الفاصل الزمني فلوري المجهر. عندما تبيض الصورة ومضان الخلفية يمكن خاضعة للإشراف، والوقت الفاصل بين التصوير يسمح التحقيقات لديناميات البروتينات هيكل الخلية واستجابة للظروف البيئية 11، 14. بشكل منفصل، وقد تقدمت تصور ديناميات خيوط الأكتين في المختبر من خلال إدخال مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري. مقارنة المجهر حقل واسع، TIRF في الاستفادة من انخفاض مضان الخلفية وتعزيز النقيض من رصد خيوط الفردية 15 و 16. مع هذه الصفات، وقد تم تكييف TIRF المجهر من قبل علماء الأحياء الخلايا لمراقبة الهياكل الخلوية في غشاء البلازما 17، 18. الأحداث الخلوية، بما في ذلك التغيرات في الهيكل الخلوي، ويمكنيمكن تصور الزمن الحقيقي مع الضيائية منخفضة، وعلى النقيض القصوى، والحد الأدنى من الإزهار الخلفية 19.
إلى فهم أفضل لتأثير الطفرات الأكتين على الحركة، والترجمة، ودوران من البروتينات هيكل الخلية في الخلية، المجهري TIRF والبروتين علامات استخدمت. هنا، يتم وصف أساليب لدراسة الآثار المترتبة على الطفرة ذات الصلة سريريا في أكتين على ديناميات هيكل الخلية في خميرة الخباز. على وجه التحديد، وتوطين وحركة بروتين ملزمة أكتين، Aip1p، تم تصور وكميا في الخلايا معربا عن الطفرة R256H في أكتين. تكمل هذه التقنيات في الدراسات البيوكيميائية المختبر والسماح لفهم أكبر للتفاعلات البروتين ووظائفها.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصفت استراتيجية فعالة لتصور ديناميات الهيكل الخلوي والأداة المساعدة في التحقيقات على الطفرات المسببة للأمراض هنا. خلقت طرائق التصوير المتقدمة فرصا جديدة لفهم حركة الخلايا من البروتينات بالقرب من غشاء الخلية. مجموع المجهري مضان التأمل الداخلي (TIRF) هي تقنية الحس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر بيتر روبنشتاين للمناقشة مفيدة والمشورة الفنية وديفيد Pellman لاستنساخ PB1996 الأصلي. وأيد هذا العمل من خلال منحة من آذار من مليم وبتمويل من ركوب للأطفال.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
