Kvantifiera Single microvessel permeabilitet i Isolerad Blod-perfusion Rat Lung Förberedelse

Summary

Den isolerade blod-perfusion lunga preparat gör det möjligt att visualisera mikrokärls nätverk på lungytan. Här beskriver vi en metod för att kvantifiera permeabilitet av enskilda mikrokärl i isolerade lungor med hjälp av realtids fluorescens avbildning.

Abstract

Den isolerade blod-perfusion lunga preparat används ofta för att visualisera och definiera signalering i enskilda mikrokärl. Genom att koppla denna beredning med realtid bildbehandling, blir det möjligt att avgöra permeabilitetsförändringar i enskilda lungmikrokärl. Häri beskriver vi steg för att isolera råtta lungor och BEGJUTA dem med autologt blod. Sedan vi beskriva åtgärder för att ingjuta fluoroforer eller agenter via en kateter in i en liten lung region. Med hjälp av dessa förfaranden som beskrivs, bestämd vi permeabilitet ökar i råttlungmikrokärl som svar på infusioner av bakteriell lipopolysackarid. Data visade att lipopolysackarid ökad vätskeläckage över både venular och kapillär mikrokärlssegmenten. Således gör denna metod det möjligt att jämföra permeabilitet svar bland kärlsegment och därmed definiera eventuella heterogenitet i svaret. Medan vanligaste metoderna för att definiera lung permeabilitet kräver efterbehandling av lungvävnadsprover, detAnvändning av realtidsavbildning undanröjer detta krav som framgår av föreliggande förfarande. Således, den isolerade preparatet lungan kombinerat med realtid bildbehandling erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella metoder för att bestämma lungmikrovaskulär permeabilitet, men är en enkel metod för att utveckla och genomföra.

Introduction

Ökad mikrovaskulär permeabilitet i lungorna leder till utveckling av alveolär ödem och nedsatt gasutbyte och är en viktig egenskap av akut lungskada (ALI) ^1-3. Således, uppskattningar av vaskulär permeabilitet är viktiga att definiera omfattningen av lungskada och effekt av föreslagna terapeutiska ingrepp. Gravimetrisk analys såsom blod fri lunga våt-till-torr-förhållandet och mikrovaskulära filtreringskoefficient används allmänt metoder för att uppskatta permeabiliteten ^4,5. Andra metoder inkluderar att kvantifiera retentionen av radioaktiva eller fluorescerande prober i lungvävnad ^6-8. Emellertid är ovanstående metoder kräver postexperiment behandling av lungvävnadsprover mot belysa permeabilitetsdata. Eftersom ett djur kan endast användas för en enda behandlingsprotokoll stora antalet djur kan behövas för en fullständig undersökning. Gemensamt för ovanstående metoder är att de bestäm medel vaskulär permeabilitet föralla blodkärl i vävnadsprovet. Men det är väl etablerat att lung mikro-och makro fartyg är fenotypiskt olika ^9. Därför kan permeabilitet svar vara heterogena bland de olika fartygssegment och ^9,10. Således kvantifiera genomsnittliga permeabilitet av alla lungkärlen i ett vävnadsprov får inte tillräckligt återspeglar denna heterogenitet.

I det isolerade blod-perfusion lunga förberedelse, kan blodkärl på lungytan visualiseras med en upprätt mikroskop ^4,11,12. Detta möjliggör karakteriserar svar i enskilda fartyg och därmed ta itu med eventuella heterogenitet i svaren ^13. Dessutom, genom användning av fluorescens avbildning av mikrokärl, fluorescensbaserade analyser kan införlivas. Vidare kan en vänster förmak mikrokateter användas för att leverera agenter och fluorescens sonder i blodkärl ^11,14. Den microcatheter begränsar leverans till en liten lung region, alltså exposera endast blodkärlen inom regionen till de infunderas agenter och fluoroforer. Detta gör att flera små regioner inom samma lunga som ska användas för separata experiment, vilket leder till en total minskning av djur som behövs för en undersökning.

Realtids avbildning möjliggör fångst av dynamiska förändringar i kärl-och extravaskulär fluorescens av enskilda mikrokärl i den isolerade lungan förberedelser. Således, för varje mikrokärls inom ett bildfält, kan spelas in förändringar i fluorescens under infusion av fluoroforer och borttvättnings, och kvantifieras offline ^14. Använda värden för maximal och resterande kärl-fluorescens, kan en permeabilitet index för varje mikrokärls inom avbildningsområdet fastställas. För att bestämma permeabilitet ändras som svar på inflammatoriska eller skadliga ämnen, kan det önskade medlet administreras först och sedan permeabiliteten index bestämdes. Dessutom kan bildfältet ställas in var som helst i lungområdet infuseras medmicrocatheter, vilket möjliggör en hög grad av flexibilitet i valet av önskad vaskulära nätverket. Således, den isolerade blod-perfusion lunga beredning i tandem med realtid bildbehandling ger en attraktiv experimentell modell för att kvantifiera permeabilitet i enstaka lungmikrokärl.

Protocol

Alla experiment som utförs på djur var som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Tennessee Health Science Center. 1. Slangar för perfusion Rat Lung Förberedelser Förbered ett slangsystem med Tygon-slang (# 18) för genomblödning såsom visas i figur 1. Anslut tryckomvandlare (P23XL) och placera röret på mikroskopställningen. Ställ vattenbadets temperatur till 37 ° C. Anslut lung inlopp oc…

Representative Results

En isolerad blod-perfusion lunga preparat ansluten till perfusion slangar och tillhörande utrustning visas i figur 2. För demonstrationsändamål, använde vi en Sprague Dawley råtta, även om de förfaranden som beskrivs här kan användas med alla råttarter. Infusioner genom en vänster förmaks katetem når endast en liten region av lungan. Den infunderade regionen kan identifieras genom infusions missfärgning (Figur 3). Lungan beredningen som positionerad för realtids bildbeha…

Discussion

Den isolerade blod-perfusion lunga preparat i kombination med realtid bildbehandling ger ett enkelt verktyg för bestämning av permeabilitetsförändringar i enstaka lungmikrokärl. Vi tillämpade denna metod för att definiera permeabilitetsförändringar som svar på infusioner av LPS. Våra data visar tydligt att LPS infusion orsakat en ökning av mikrovaskulär permeabilitet. Vidare data indikerar också att permeabilitetsförändringar inducerade av LPS var liknande i båda venoler och kapillärer. Således är en…

Materials

Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole  and a handle  to secure o-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4