HaloTag 기술은 포유 동물 세포에서 크고 작은 단백질 단지의 분리에 상당한 성공을 보이고있다 다기능 기술입니다. 여기에서 우리는 기존의 대안에 비해이 기술의 장점을 강조하고 진핵 세포 내에서 단백질 기능의 다양한 측면을 연구하기 위해 유틸리티를 보여줍니다.
프로테오믹스 연구는 바이러스, 박테리아, 효모에서 그 등 다양한 프로테옴의 특성을 이끌고있다 질량 분석 기능의 발전과 함께 최근 몇 년 동안 폭발했다. 비교에서는, 인간 프로테옴의 분석은 부분적으로 인해 공부를해야합니다 단백질의 완전한 숫자뿐만 아니라, 네트워크와의 상호 작용이 존재의 복잡성에 뒤쳐. 특히 인간 프로테옴을 이해하는 문제를 해결하기 위해, 우리는 단백질 분리를 위해 HaloTag 기술을 개발 multiprotein의 단지의 분리에 특히 강하고 낮은 풍부 약하거나 과도 상호 작용 및 / 또는 단백질을보다 효율적으로 캡처를 허용했다. HaloTag는 유전자 인코딩 단백질 융합 공유를 위해 디자인 태그, 특정, 신속한 고정 또는 다양한 리간드 단백질의 라벨입니다. 이러한 특성을 활용, 포유 동물 세포에 대한 여러 응용 프로그램은 문자로 개발되었다단백질 기능을이지는 여기에 우리는 등의 방법론을 제시 : 단백질의 새로운 상호 작용 또는 기능 분석의 발견에 사용되는 풀다운, 셀룰러 현지화. 우리는 속도, 특이도, 그리고 다른 전통적인 비 공유 방식에 비해 단백질 체학 분석을 위해 표면에 융합 단백질의 공유 캡처에서 상당한 장점을 찾을 수 있습니다. 우리는이 예제와 인간의 bromodomain 단백질 BRD4 및 히스톤 디 아세틸 라제의 HDAC1으로 두 가지 중요한 성적인 단백질을 사용하여 기술의 다양한 유틸리티를 보여줍니다. 이러한 예는 새로운 상호 작용의 발견을 가능하게하고 진핵 생물의 세포 지방화의 특성이 기술의 힘을 입증하는 것입니다 인간의 기능 단백질 체학 함께 더 이해.
세포 기능, 자극에 대한 반응, 개발 및 / 또는 질병 상태의 변화에 대한 이해가 복잡하게 서로 다른 동적 상태 1,2에 걸쳐 프로테옴의 탈 회선에 연결되어 있습니다. 대부분은 단백질의 수와 가능한 모든 상호 작용을 지정해,이 인간 프로테옴 1,3-7를 해결하기에 매우 도전하고있다, 그러나 낮은 유기체의 프로테옴을 이해하기 위해 수행되었다. 질량 분석의 발전은 크게 이러한 연구를 수행 할 수있는 기능을 사용할 수 있고, 여기에 우리는 단백질 복합체 및 포유 동물 세포 8-10에서 인간 단백질의 기능 특성을 모두 효율적으로 캡처 HaloTag 기술의 발달과 함께 추가로 상당한 발전을 제시한다. 이 기술은 최근에 새로운 단백질의 기능과 understandi에 대한 통찰력을 허용, 중요한 상호 작용의 발견을위한 중요한 요소로 여러 연구에서 밝혀졌다질병 11 ~ 13 NG.
HaloTag 단백질 융합은 초기에 기존의 친 화성 태그와 단백질 캡처, 정화, 및 표시 8-10으로 관련 항체의 여러 문제를 해결하기 위해 개발되었다. 단백질 캡처 및 정화에 거의 모든 메소드에서, 특정 단백질 (14)의 농축을 위해 사용되는 비공 유적 상호 작용 단계가있다. 이 단계에서, 단백질 및 / 또는 복잡한 프로세스를 완료하는 데 시간이 아닌 분을 필요로 특히, 확산에 의한 끊을 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 융합 단백질은 특히 신속하고 비가 역적으로 입자 표면 또는 형광체 9가 될 수있는 그것의 리간드와 상호 작용하도록 설계되었다. 그 때문에이 그 리간드에 결합되면, 다른 친 화성 태그에 비해 가장 차별화 요인 중 하나이며, 이는 바인딩 남아있다. 또한 여기에 입증하는 기능입니다리간드 9 (그림 1) 교류 가능합니다 하나의 구조로 서로 다른 생물학적 문제를 해결하기 위해. 예를 들어, 단백질 상호 작용 또는 기능을 심문하기 위해, 표면의 리간드 단백질이나 단지의 캡처 (그림 1)에 사용됩니다. 별도의 실험에서, 같은 융합 단백질 형광 세포의 현지화, 인신 매매, 또는 단백질 회전율 (그림 1) 공부를 표시 할 수 있습니다. 그것은 리간드가 돌이킬 수없는, 그것은 표면 또는 형광인지, 바인딩 때문에 다른 리간드 다음 이후에 같은 실험에 바인딩 할 수 없습니다 그러나 그 한 번 기억하는 것이 중요하다.
단백질 상호 작용을지도하는 기존 기술의 분석은보다 효율적으로 과도하거나 낮은 풍부 1,6,7,14,15에있는 사람들을 포함하여 특정 상호 작용을 분리하는 어려움을 알 수있다. 다수의 그룹에 의해 또한, 최근 작업설정 해제는 전통적인 분리 방법 내에서 특히 인간 단백질 체학의 영역에서, 질량 분광 분석 (16)의 진정한 인터랙로부터 신호를 마스크 할 수 단백질 오염물의 상당수가 있다는 우려를 나타낸다. HaloTag 단백질과 잘 자사의 공동 개발 수지 주소 이러한 문제를 위해 개발 된 속성. 복합체 소재의 결합 복합체 풀다운위한 프로토콜 (도 1)는, 모두 복잡한 캡처를 촉진하고 비특이적 8 결합의 수준을 감소, 15 분에서 달성 될 수있다. 또한, 비가 역적으로 결합 낮은 풍부한 단백질의 효율적인 캡쳐를 허용하고 훨씬 더 적은 세포의 사용을 허용한다, 다시 배경 8을 감소시킨다. 복합체의 포획이 설정되면, 프로토콜은 복잡 무결성을 유지하기 위해 온화한 세척 조건을 포함한다. 캡처 단지의 용출 방법이 하류 항문의 목표에 의해 결정됩니다 두 가지 방법과 선택하여 수행 할 수 있습니다ysis. 욕구 분석 또는 웨스턴 블롯 또는 질량 분석에 의해 상호 작용하는 단백질을 발견 할 수 있다면, 그것은 이러한 SDS 또는 요소 (그림 1)과 같은 변성제와 복합체를 용출하는 것이 좋습니다. 이것은 원래 HaloTag에 융합 단백질이, 미끼 단백질이라고으로, 수지에 결합 된 뒤에 남아 있고, 따라서 질량 분석에서 검출 된 펩티드의 인구를 지배하지 않습니다 질량 분석에 특히 유리하다. 이것은 또한 미끼 단백질 가능성이 서양 얼룩, 다른 비 공유 결합 친 화성 않는 정화 또는 공동 immunoprecipitations에 비해 유의 한 차이에 의한 분석에 표시되지 않습니다하지만 것을 의미한다. 목표는 기능 연구를 위해 사용되는 복잡한 그대로를 정화하는 경우, 용출은 융합 단백질 및 미끼 단백질 (도 1) 사이에 인코딩 된 동족 절단 시퀀스를 인식 TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제를 사용하여 수행 될 수있다. 티HESE 샘플은 질량 분석법에 의해 분석 될 수 있지만 나중에 바와 같은, 그들은 하부 풍요의 검출, 특정 인터랙 못할 수도 미끼 단백질의 상당한 양을 포함 할 것이다.
여기서 우리는 두 가지 중요한 치료 적 단백질, bromodomain 단백질 BRD4와 히스톤 디 아세틸 라제, HDAC1 17에 적용 풀다운 및 이미징 프로토콜을 제시한다. 질량 분석, HDAC1 복잡한 분리 한 후 효소 활성, 그리고 모두를위한 적절한 세포 지방화에 의해 결정으로 우리는 예상 파트너와 이러한 예, 상호 작용을 보여 주었다. 함께, 이러한 결과는 진핵 생물의 단백질 상호 작용과 기능의 특성에 대한 기술의 다기능 자연과 강도를 보여줍니다.
두 개의 융합 단백질, 헤일로 – BRD4 및 헤일로 – HDAC1, 표현 진핵 포유 동물 세포에있어서, 단백질 복잡한 분리 및 활동, 및 세포 현지화 여기에 소개하고 있습니다. 이러한 다양한 프로토콜을 통해 작업, 각 실험의 성공을 위해 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 자체가 생리를 유지하기위한 중요 할 수있는 태그의 융합 단백질 발현 수준과 배치를 가진 경우가있는 바와 같이. 그것은 사전 지식 또는 다른 태그와 함께 작동 선택의 특정 단백질에 대한 입증되지 않은 경우 N-및 / 또는 C-말단 융합 설계해야 할 필요가 있다고 생각하는 것이 중요하다. 레벨이 너무 높으면 식 대하여, DNA의 희석은 적절한 수준을 달성하기 위해 더 약한 프로모터와 벡터의 형질 감염 또는 사용중 가능 수행 될 수있다. 이전 작업은 내생 르에서 고분자 복합체의 효율적인 분리를 보여주는 수행 한표현의 매우 낮은 수준에서 작업을 가능하게 표현 8 VELS. 가능하면, 셀룰러 지역화 연구는 또한 적절한 생리 필요한 태그 최적 배치 위치뿐만 아니라 상대적 발현 수준으로 통찰력을 제공 할 수있을 것이다.
융합 단백질은 가장 큰 장점 중 하나로서 복잡한 분리의 속도가, 그 바인딩, 용해에 권장 시간 프레임을 수행하는 것이 매우 중요 프로토콜 및 세척 섹션으로 최대의 성공을 얻으려면 풀다운 실험 준비가되면 과정. 다음 단계 중 하나가 시간을 길게하는 경우 등이 항체 기반의 캡처 방법이 필요합니다,, 복잡한 연결 해제의 위험 또는 8 바인딩 증가 비 특이성이있다. 시간이 세포의 용해 또는 바인딩 중에 단축된다 마찬가지로 경우, 세포가 완전히 용해 또는 효율적으로 각각 캡처 할 수 없습니다. 세척의 수가 DECR 경우완화 또는 수지의 양호한 혼합이 바인딩 또는 세척 동안 발생하지 않으며, 그 후에 비 특정 단백질의 배경 수준은 증가 될 것이다. 또한, 용해의 수단은 수지에 결합 효율에 관련된 매우 중요합니다. , 샘플을 초음파 처리 권장 세제를 제거 SDS 또는 기타 강한 세제를 추가 및 / 또는 단백 분해 효소 억제제 AEBSF을 포함하는 시도는 감소 또는 수지에 융합 단백질 및 그 복합체의 결합의 손실이 발생할 것입니다.
포유 동물 세포와 질량 분석기 (16)에 의해 분석의 배경을 줄이는 문제와 인간 단백체 분석 투쟁 복잡한 격리를위한 기존의 방법. 이 오염 단백질의 저장소가 많은 질량 분석 그룹 (16)에 의해 생성 된 너무 큰했습니다. 질량 분석 풀다운 시료에서 배경의 식별을 방지 아무것도 정의 될 수있다미끼 단백질의 진정한 인터랙. 이와 같이, 배경이 비 특정 단백질 또는 미끼 또한 단백질 또는 미끼 단백질을 침전에 사용 된 항체의 농도가 큰 오염으로부터 발생할 수있다. 많은 작업은 여기에 제시된 풀다운 프로토콜뿐만 아니라 풀다운 프로세스 비특이적 오염 단백질의 수준을 최소화하는 수지 모두를 최적화로 이루어졌다. 이 실버 얼룩 젤과 컨트롤의 질량 분석 분석 (그림 2)에 분명하다. 미끼 단백질 또는 다른 방법 투쟁되는 오염 물질로 동일하게 유해 할 수있는 항체의 높은 수준의 문제를 해결하기 위해, SDS의 용출과 풀다운은 (프로토콜 2.4)을 추천합니다. 때문에 수지에 공유 결합으로,이 과정은 공유 결합 수지에 부착 초기 융합 단백질의 대부분을 남겨 둘 것이다. 미끼의 작은 비율 믿고 질량 분광 분석에서 관찰가수 분해를 통해 발생하는,하지만 다른 약한 또는 과도 상호 작용 (8)의 검출에 문제가되지 않습니다.
서론에서 언급 한 바와 같이, 단백질 체학에서 상당한 발전이 질량 분석 1.7에서 상당한 진보가 활성화되었습니다. 따라서, 풀다운에서 얻어진 단백질의 혼합물을 deconvolute 질량 분광 분석의 선택의 중요한 파라미터를 강조하는 것이 중요하다. 계측은 견고하고 일상적 효율적 <1 μg보다 덜 자주 단백질의 소량을 함유하는 샘플을 분석 할 수 있어야한다. 100-300 NL / 분 범위의 유속으로 50 ~ 75 ㎛의 내부 지름 HPLC 컬럼을 포함하는 나노 스케일 크로마토 그래피는 일반적으로 작은 샘플 크기와의 호환성을 위해 채용되며, 질량 분석 장치의 감도를 최대화하기 위해. 하나의 분석 상태 O를 획득 한 정보를 최대화하려면F 상기 나노 분리와 호환되는 시간 척도, ≥ 10 Hz에서 높은 해상도의 질량 스펙트럼을 획득 할 수있는 예술의 질량 분석기는 일반적으로 사용된다. 이 장비는 감도 아토 몰 수준이 일상적으로 서브 ppm의 전구체 및 제품 이온 질량 오류 허용 오차 데이터를 수집 할 수 있습니다. 이러한 성능 특성은 단백질의 식별 번호의 수율 및 그 동정과 관련된 신뢰를 증가시키는 역할을한다.
새로운 상호 작용의 발견 가능성과 함께 단백질 상호 작용, 모든 하나의 구문을 사용하여 활성 물질의 분리 :이 자료로 우리는 생리 세포 현지화, 적절한 단백질을 보여줍니다. 실제로 대체 기술은 있지만, 그렇지 않은 모든 23,24, 이러한 다양한 측면의 각각에 대해 사용될 수있다. HaloTag 기술, 다기능 방법은 proteom 발전, 이용 될 수있다ICS 연구 및 포유 동물 세포에서 단백질 기능의보다 완전한 이해를 얻을 수있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원고의 중요한 읽기 닥터 마틴 로젠버그 박사 게리 타 플레이, 박사 키스 우드이 작품의 지원, 박사 제임스 칼리 감사합니다. DLD, JM, HB, NM,, JC, 그리고 MU는 프로 메가 코퍼레이션의 직원입니다. MF, RJ, RA 및 DA는 MS 바이오 웍스 (Bioworks), LLC의 직원입니다.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |