的HaloTag技术是显示在小和大的蛋白质复合物从哺乳动物细胞中分离显著成功的多功能技术。在这里,我们重点介绍了这项技术的优势比现有的替代品,并展示其效用研究蛋白质功能的许多方面里面的真核细胞。
研究蛋白质组学已经爆炸,近年来随着质谱能力的进步,导致了众多的蛋白质组,包括那些来自病毒,细菌和酵母的特性。相比之下,人类蛋白质组的分析滞后,部分原因是由于绝对数量必须研究的蛋白质,而且网络和这些存在相互作用的复杂性。专门解决理解人类蛋白质组的挑战,我们已经开发的HaloTag技术,蛋白分离,多蛋白复合物分离尤为强劲,并允许在低丰度弱或短暂的相互作用和/或蛋白质的更有效的捕获。的HaloTag是一种基因编码的蛋白融合标签,专为共价键,具体,并迅速固定或与各种配体蛋白的标记。凭借这些特性,开发,以人物众多应用的哺乳动物细胞IZE蛋白质的功能,在这里,我们提出的方法,包括:用于发现新的相互作用和功能分析蛋白质的下拉功能,以及细胞定位。我们发现显著优势,在速度,特异性,和融合蛋白对表面进行蛋白质组分析,相对于其他传统的非共价方法的共价捕获。我们证明这些和使用两个重要的后生蛋白质作为例子,人的溴区蛋白BRD4和组蛋白脱乙酰基酶HDAC1该技术的广泛的实用性。这些例子说明了该技术在实现新颖的交互的发现和真核生物中表征细胞定位的权力,这将进一步共同了解人性化的功能蛋白质组学。
了解细胞功能,对刺激的反应,并转变发展方式和/或疾病状态是密切关联的去卷积的蛋白质在整个这些不同的动态状态1,2。已作出很大努力来理解低等生物的蛋白质组,但是,给定的蛋白质的数量与所有可能的相互作用,这是非常具有挑战性的寻址人类蛋白质组1,3-7。在质谱的进展,极大地激活可进行这些研究的能力,在这里,我们提出了一个额外的和显著的进步与的HaloTag技术的发展为蛋白质复合物和哺乳动物细胞8-10人体蛋白质功能特性的既有效捕获。此技术最近已显示在几项研究是为发现的重要的相互作用的一个关键因素,允许洞察新的蛋白质功能和understandi吴疾病11-13。
该蛋白质的HaloTag融合最初开发是为了解决传统的亲和标签和抗体可作为相关蛋白捕获,纯化和标记8-10几个挑战。内几乎所有方法的蛋白质捕获和纯化,有其用于特定蛋白14的浓缩的非共价相互作用的步骤。在此步骤中,蛋白和/或络合物可以解离,由于扩散,特别是如果该过程需要时间,而不是分钟来完成。为了解决这一问题,该融合蛋白是专门设计,以快速和可逆地与其配体的相互作用,这可以是颗粒,表面,或荧光团9。因此,一旦它被绑定到其配体,它仍然绑定,这是最差分系数,相对于其他的亲和标签中的一个。这里还展示,是能够以解决不同的生物学问题用单个构建体,其可以通过交替配体9( 图1)。例如,询问蛋白质相互作用或功能,表面配体可用于捕获的蛋白质或复合物( 图1)。在另一项实验中,同样融合蛋白可被荧光标记,研究细胞定位,贩运,或蛋白质周转( 图1)。要记住然而,一旦配体结合,无论是表面或荧光团,它是不可逆的,因此,其它的配体不能再被随后捆绑在相同的实验是非常重要的。
现有的技术来映射蛋白质相互作用的分析揭示了难度,有效地隔离特定的相互作用,包括那些更短暂的或现在的低丰度1,6,7,14,15。此外,最近的工作由无数组s显示了在传统的分离方法,特别是在人类蛋白质组学领域,也有显著数量的蛋白质污染物可能掩盖真正来自于交互件质谱分析16个信号的关注。为的HaloTag蛋白及其共同开发的树脂地址以及这些关注开发的物业。在可以在15分钟内实现的协议复杂的下拉( 图1),复合物的结合,既促进复合物捕获和减少非特异性结合8水平。另外,不可逆地结合允许对低丰度蛋白的高效捕获并允许使用少得多的细胞,再一次减少背景8。一旦复合物的捕获建立后,协议包括温和的洗涤条件,以维护复杂的完整性。捕获复合物的洗脱可以通过两种方法和所选择哪种方法由下游肛门的目标决定进行ysis。如果愿望是分析或通过蛋白质印迹或质谱发现相互作用的蛋白质,那么建议以洗脱物与变性剂如SDS或尿素( 图1)。这是用于质谱测试的特别有利的,因为最初稠合的HaloTag蛋白,称为诱饵蛋白,将留在后面结合到树脂中,因此不会主导的质谱检测的肽的人口。这也意味着然而,该诱饵蛋白很可能是不可见的由免疫印迹,一个显著差异,相对于其他的非共价亲和纯化或共免疫沉淀分析。如果目标是达到净化复杂原封不动地用于功能研究,洗脱可以使用TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶,其识别的融合蛋白和诱饵蛋白( 图1)之间的编码其同源序列裂解来进行。 Ŧ淡褐色样品也可以通过质谱法进行分析,但如后所示,它们将包含一个显著量诱饵蛋白,可能会阻止检测低丰度的,特定交互件。
在这里,我们提出了适用于两个重要的治疗蛋白,该蛋白溴区BRD4和组蛋白去乙酰化酶,HDAC1 17下拉和成像协议。我们已经证明具有这些例子中,与预期伙伴相互作用如通过质谱法,经过复杂的隔离HDAC1酶活性,并为适当的细胞定位来确定。总之,这些结果证明了该技术的真核细胞蛋白质的相互作用和功能特性的多功能性质和强度。
这里介绍两种融合蛋白,晕 – BRD4和Halo-HDAC1,其特征在于真核哺乳动物细胞中进行表达,蛋白复合物的分离和活性,细胞定位。通过这些不同的协议工作,有针对每个实验的成功几个重要的步骤。由于是与它本身可以保持生理的关键变量的任何融合蛋白的表达水平和位置的情况下。因此,重要的是要考虑到的N-和/或C-末端融合将需要进行设计,如果先验知识或与其他标记工作尚未得到证实供选择的特定的蛋白质。对于表达,如果电平太高,可以转染的载体或使用过程中执行较弱的启动子的DNA稀释的都可以实现,是适当的水平。前期工作已经完成,显示在勒内源性大分子复合物的高效分离表达式8的VELS,使工作在表达水平非常低。如果可能的话,细胞定位研究也将能够提供答案为需要进行适当的生理最优标签放置位置以及相对表达水平。
一旦融合蛋白是准备下拉实验,以获得最大的成功与该协议是非常重要的,以跟随在裂解建议的时间帧,绑定和洗涤部分,作为最大的优点之一是复杂的隔离的速度过程。如果上述任何步骤被延长时间,例如,需要对基于抗体的捕获方法,存在复杂的解离的危险或增加非特异性结合8。同样,如果在次期间,细胞裂解或有约束力的缩短,电池可能无法完全溶解或分别有效地捕获。如果洗涤次数是DECR缓解或在结合或洗涤液,不会发生树脂的良好混合,然后非特异性蛋白的背景水平会有所提高。此外,裂解的手段是作为相关的结合效率与树脂非常重要的。企图超声处理的样品中,去掉了推荐的洗涤剂,添加SDS或其它强的洗涤剂和/或包含所述蛋白酶抑制剂AEBSF将导致减少或融合蛋白和它们的复合物结合到树脂上的损失。
从哺乳动物细胞和人类蛋白质组分析的奋斗与减少的背景中分析通过质谱16的挑战,复杂的隔离现有的方法。这一直显著,杂蛋白的存储库已经建立了众多的质谱组16。背景质谱下拉样品中可以被定义为任何能够防止识别诱饵蛋白的真实干扰作用。因此,背景可以产生污染的非特异性蛋白质或也较大浓度诱饵蛋白或用来沉淀诱饵蛋白的抗体。显著工作是在优化二者这里提出的下拉协议以及该树脂,以减少在下拉过程中的非特异性的杂蛋白的水平进行。这是显而易见的,在银染的凝胶和控制的质谱分析( 图2)。解决高层次诱饵蛋白,或可以同样有害的污染物,并与其他方法斗争的抗体,用SDS洗脱下拉建议(协议第2.4节)。由于共价连接到树脂上,这个过程会留下大部分的起始融合蛋白的共价连接到树脂上。诱饵的一小部分在质谱分析,这被认为是观察发生通过水解,但它不用于检测其它较弱或瞬时相互作用8提出一个问题。
正如引言中所述,在蛋白质组学显著的进步已经由质谱1,7显著的进步启用。因此,突出质谱分析的选择的重要参数,以解卷积的下拉得到的蛋白质的混合物是重要的。仪器必须可靠并且能够定期地和高效地分析含有少量的蛋白质,通常比<1微克更少的样品。涉及50-75微米内径HPLC柱用的流速在100〜300升/分钟范围内的纳米级色谱通常采用用于与小样本的相容性和最大化质谱仪的灵敏度。为了最大限度地在一个单一的分析状态Ø获得的信息f能够在时间尺度与前述的纳米级分离兼容,≥10赫兹获取高分辨质谱的技术质谱仪,通常采用。这些仪器具有灵敏度attomolar水平,并能经常获得与子ppm的前体和产物离子质量误差容限的数据。这些性能特征,以提高识别的蛋白的数量的产率和与这些标识关联的置信度。
有了这些数据,我们证明生理细胞定位,适当的蛋白质:蛋白质相互作用以及潜在的发现新的相互作用,以及所有使用单个构造活跃的复合物隔离。确的替代技术可用于所有这些不同的方面,但可能不适合所有23,24。用的HaloTag技术,多官能的方法都可以使用,前进蛋白质组学ICS的研究并获得在哺乳动物细胞中的蛋白质功能的更完整的理解。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢马丁·罗森伯格博士,加里·塔普利博士和Keith木博士支持这项工作,和詹姆斯卡利博士的手稿的批判性阅读。 DLD,JM,HB,NM,AN,JC,和MU是Promega公司的雇员。 MF,RJ,RA和DA是MS Bioworks,有限责任公司的员工。
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |