HaloTag technologie is een multifunctionele technologie die heeft significante succes afzonderlijk van zowel kleine als grote eiwitcomplexen van zoogdiercellen. Hier hebben we aandacht voor de voordelen van deze technologie ten opzichte van bestaande alternatieven en demonstreren zijn nut op tal van aspecten van de functies van eiwitten in eukaryote cellen te bestuderen.
Onderzoek in proteomics is geëxplodeerd in de afgelopen jaren met de vooruitgang in massaspectrometrie mogelijkheden die hebben geleid tot de karakterisering van tal proteomen, waaronder die van virussen, bacteriën en gist. Ter vergelijking, analyse van de menselijke proteoom achterblijft, mede door het grote aantal eiwitten dat moet worden onderzocht, maar ook de complexiteit van netwerken en interacties die aanwezig. Specifiek ingegaan op de uitdagingen van het begrijpen van de menselijke proteoom, hebben we HaloTag technologie ontwikkeld voor eiwitisolatie, bijzonder sterk voor isolatie van multiprotein complexen en een efficiëntere vangst van zwakke of voorbijgaande interacties en / of eiwitten in lage overvloed. HaloTag is een genetisch gecodeerd eiwitfusie tag, ontworpen voor covalente, specifieke en snelle immobilisatie of de etikettering van eiwitten met verschillende liganden. Gebruik te maken van deze eigenschappen, werden tal van toepassingen voor zoogdiercellen ontwikkeld om karakterize eiwit functie en hier presenteren we methodieken zoals: eiwit pull-downs gebruikt voor ontdekking van nieuwe interacties of functionele assays, en cellulaire lokalisatie. We vinden significante voordelen snelheid, specificiteit en covalente vangst van fusie-eiwitten aan oppervlakken voor proteoomanalyse in vergelijking met andere traditionele niet-covalente benaderingen. We tonen deze en de brede toepasbaarheid van de technologie met behulp van twee belangrijke epigenetische eiwitten als voorbeelden, de menselijke bromodomain eiwit BRD4 en histondeacetylase HDAC1. Deze voorbeelden tonen het vermogen van deze technologie waardoor de ontdekking van nieuwe interacties en karakteriseren van cellulaire lokalisatie in eukaryoten, die samen beter begrip van menselijke functionele proteomics wil.
Begrip van cellulaire functie, reactie op stimuli, en veranderingen in de ontwikkeling en / of ziektetoestanden is onlosmakelijk verbonden met de-convolutie van het proteoom tijdens deze verschillende dynamische toestanden 1,2. Er is veel gedaan om het proteoom van lagere organismen te begrijpen, echter, gezien het aantal eiwitten en alle mogelijke interacties, dit is zeer uitdagend geweest in de aanpak van het menselijk proteoom 1,3-7. Vooruitgang in de massaspectrometrie zijn sterk staat het vermogen om deze onderzoeken uit te voeren, en hier geven we een bijkomende en belangrijke vooruitgang met de ontwikkeling van HaloTag technologie voor zowel efficiënte vangst van eiwitcomplexen en functionele karakterisering van menselijke eiwitten van zoogdiercellen 8-10. Deze technologie is recentelijk verscheidene studies aangetoond dat een kritische factor voor ontdekking van belangrijke interacties, waardoor inzicht in nieuwe eiwitfunctie en understanding ziekte 11-13.
De HaloTag eiwitfusie werd aanvankelijk ontwikkeld om een aantal uitdagingen van de traditionele affiniteit tags en antilichamen als gerelateerd aan eiwit vastleggen, zuivering, en de etikettering 8-10 pakken. In bijna alle methoden voor eiwit vangen en zuivering, er een niet-covalente interactie stap die wordt gebruikt voor de verrijking van een bepaald eiwit 14. Tijdens deze stap kunnen de eiwitten en / of complexe scheiden door diffusie, vooral als het proces vereist uren in plaats van minuten. Om dit probleem aan te pakken, werd het fusie-eiwit speciaal ontworpen om snel en irreversibel interactie met de liganden, die hetzij deeltjes, oppervlakken of fluoroforen 9. Daarom wanneer het is gebonden aan het ligand ervan, blijft gebonden, een van de meest onderscheidende factor in vergelijking met andere affiniteit tags. Ook hier blijkt, is de mogelijkheidverschillende biologische vragen te behandelen met een construct dat kan door afwisselende liganden 9 (figuur 1). Bijvoorbeeld, eiwit interacties of functie ondervragen oppervlak liganden worden gebruikt voor het vangen van eiwitten of complexen (figuur 1). In een apart experiment, kan hetzelfde fusie-eiwit fluorescent gelabeld zijn om cellulaire lokalisatie, handel, of eiwit omzet (figuur 1) te bestuderen. Het is belangrijk om te onthouden maar dat zodra een ligand gebonden is, of het nu een oppervlak of een fluorofoor is onomkeerbaar en daarom zijn andere liganden kan dan later in hetzelfde experiment gebonden.
Analyse van de bestaande technologieën om eiwit interacties in kaart onthullen de moeilijkheid om efficiënt isoleren specifieke interacties, inclusief die welke meer voorbijgaande zijn of in de lagere overvloed 1,6,7,14,15. Ook recent werk van talrijke groepstentoonstellingentoont de zorg dat binnen de traditionele isolatiemethoden, met name op het gebied van menselijke proteomics, zijn er een groot aantal eiwitverontreinigingen welke signalen kunnen maskeren waar interactors in massaspectrometrie 16. De vastgoed ontwikkeld voor de HaloTag eiwit en zijn mede-ontwikkeld hars adres goed deze bezorgdheid. In het protocol voor complexe pulldown (figuur 1), binding van complexen kan op 15 min, zowel bevordering complex vangen en het verminderen niveaus van niet-specifieke binding 8. Bovendien irreversibel binden maakt efficiënte vangst van lage abundantie proteïnen en maakt het gebruik van veel minder cellen opnieuw reduceren achtergrond 8. Zodra vangst van complexen is gevestigd, het protocol bevat milde wascondities om complexe integriteit te behouden. Elutie van de gevangen complexen kunnen worden uitgevoerd door twee werkwijzen en kiezen welke werkwijze wordt bepaald door het doel van de stroomafwaartse analelyse. Als de wens is om te analyseren of ontdek interagerende eiwitten door Western blot of massaspectrometrie, dan is het raadzaam om complexen elueren met denatureermiddelen zoals SDS of ureum (figuur 1). Dit is bijzonder voordelig voor massaspectrometrie als het oorspronkelijke eiwit gefuseerd aan HaloTag, zogenaamde aas eiwit zal achter gebonden aan het hars blijven en daarom zal de populatie van peptiden gedetecteerd in de massaspectrometrie niet domineren. Dit betekent echter ook dat het aas eiwit waarschijnlijk niet zichtbaar in de analyse met western-blot, een significant verschil in vergelijking met andere niet-covalente affiniteit zuivering of co-immunoprecipitaties. Als het doel is het zuiveren complex intact worden voor functionele studies, kan elutie worden uitgevoerd met TEV (Tobacco Etch Virus) protease, die de verwante splitsing wordt gecodeerd tussen het fusie-eiwit en het aas eiwit (Figuur 1) herkent. Teze monsters kunnen worden geanalyseerd door massaspectrometrie, maar zoals later getoond, zullen ze een aanzienlijke hoeveelheid lokaas eiwit dat detectie van lagere overvloed specifieke interactors kan verhinderen bevatten.
Hier presenteren we pulldown en imaging protocollen toegepast op twee belangrijke therapeutische proteïnen, de bromodomain eiwit BRD4 en een histonedeacetylase, HDAC1 17. Wij hebben aangetoond deze voorbeelden, interactie met verwachte partners zoals bepaald met massaspectrometrie, enzymatische activiteit na complexe isolement HDAC1 en goede cellulaire lokalisatie beide. Samen tonen deze resultaten de multifunctionele aard en de sterkte van de techniek voor de karakterisering van eukaryote eiwit interacties en functies.
Hier voorgesteld zijn twee fusie-eiwitten, Halo-BRD4 en H-HDAC1 kenmerk eukaryote zoogdiercellen voor expressie, eiwitcomplex isolatie en activiteit en cellulaire lokalisatie. In het werken door middel van deze verschillende protocollen, zijn er een aantal belangrijke stappen voor het succes van elk experiment. Zoals het geval is met een fusie-eiwit expressieniveau en plaatsing van de tag zelf kan cruciaal voor het handhaven fysiologie. Het is daarom belangrijk om te overwegen dat N-en / of C-terminale fusies moet worden ontworpen indien voorkennis of met andere label is niet aangetoond voor de specifieke gekozen eiwit. Wat expressie, als het te hoog is, verdunning van DNA kan worden tijdens transfectie of het gebruik van vectoren uitgevoerd met zwakkere promoters mogelijk het passend niveau is bereikt. Eerder werk heeft verricht waaruit blijkt efficiënte isolatie van macromoleculaire complexen aan endogene levels van meningsuiting 8, waardoor het werk op zeer lage niveaus van meningsuiting. Indien mogelijk, zou cellulaire lokalisatie studies ook in staat om inzicht te verschaffen over de optimale tag plaatsing positie als relatieve expressie niveau nodig voor een goede fysiologie.
Wanneer de fusie-eiwitten zijn klaar voor pulldown experimenten maximale succes te verkrijgen met het protocol is het zeer belangrijk om de aanbevolen tijd frames in de lysis volgen binding en wassen secties, als een van de grootste voordelen is de snelheid van het complex isolatie proces. Als een van deze stappen worden verlengd in de tijd, zoals vereist is voor een antilichaam gebaseerde opnamemethode, bestaat het risico van complexe dissociatie of verhoogde niet-specifieke binding 8. Ook als de tijden cellulaire lysis of bindende verkort, cellen niet volledig gelyseerd respectievelijk efficiënt gevangen. Als het aantal wasbeurten is decrverlicht en goed mengen van de hars niet tijdens de dwingende of wast vervolgens achtergrondniveaus van niet-specifieke eiwitten worden verhoogd. Ook de middelen lysis is zeer belangrijk in relatie tot de bindingsefficiëntie aan de hars. Pogingen om ultrasone trillingen de monsters, verwijder de aanbevolen wasmiddel toevoegen SDS of andere sterke oplosmiddelen en / of die de protease inhibitor AEBSF leidt tot verminderde of verlies van binding van fusie-eiwitten en hun complexen aan de hars.
Bestaande methoden voor complexe isolatie van zoogdiercellen en menselijk proteoom analyse worsteling met de uitdaging om de achtergrond in de analyse met behulp van massaspectrometrie 16. Dit is zo omvangrijk dat een opslagplaats van verontreinigende proteïnen is gemaakt door tal van massaspectrometrie groepen 16 geweest. Achtergrond in massaspectrometrie pulldown monsters kunnen worden gedefinieerd als alles wat geïdentificeerd voorkomtware interactoren van het aas eiwit. Als zodanig kan achtergrond voortvloeien uit verontreinigend niet-specifieke eiwitten of ook grote concentraties van lokaas eiwitten of antilichamen gebruikt lokaas eiwitten precipiteren. Significante werk verricht optimaliseren zowel de pulldown protocol hier gepresenteerd als de hars op het niveau van de niet-specifieke verontreinigende proteïnen in het pulldown te minimaliseren. Dit blijkt uit de zilverkleuring gels en massaspectrometrie analyse van de controle (Figuur 2). De hoge niveaus van lokaas eiwit of antilichamen die even schadelijk als contaminanten en waarmee andere methodieken strijd kunnen aanpakken, is het pulldown met SDS elutie aanbevolen (Protocol paragraaf 2.4). Door de covalente hechting aan de hars, zal dit proces de meeste van de uitgangsmaterialen fusie-eiwit covalent aan de hars te verlaten. Een klein percentage van aas wordt waargenomen in de massaspectrometrische analyse, waarvan wordt aangenomenplaatsvinden door hydrolyse, maar het is geen probleem voor de detectie van andere zwakkere of transiënte interactie 8.
Zoals vermeld in de inleiding, hebben aanzienlijke vooruitgang in proteomics ingeschakeld door aanzienlijke vooruitgang in massaspectrometrie 1,7. Daarom is het belangrijk om belangrijke parameters voor de keuze van massaspectrometrie analyse wijzen aan het mengsel van eiwitten verkregen in de pulldown deconvolute. Instrumenten moeten robuust en kunnen routinematig en efficiënt analyseren van monsters met een kleine hoeveelheid eiwitten, vaak minder dan <1 ug zijn. Nanoscale chromatografie met 50-75 urn inwendige diameter HPLC kolommen met stroomsnelheden in het 100-300 nl / minuut en wordt typisch gebruikt voor compatibiliteit met de kleine steekproeven en de gevoeligheid van de massaspectrometer maximaliseren. Om de verworven in een enkele analyse staat o informatie te maximaliserenf de kunst massaspectrometers kunnen overnemen hoge resolutie massa spectra op een tijdschaal verenigbaar is met voornoemde nanoschaal scheidingen, ≥ 10 Hz, worden typisch gebruikt. Deze instrumenten hebben attomolar niveaus van gevoeligheid en kan routinematig gegevens met sub ppm voorloper en product ionenmassa foutenmarges verwerven. Deze prestatiekenmerken dienen om de opbrengst van het aantal geïdentificeerde eiwitten en het vertrouwen in verband met deze identificaties verhogen.
Met deze gegevens tonen we fysiologische cellulaire lokalisatie, goede eiwit: eiwit interacties met potentieel voor ontdekking van nieuwe interacties en isolatie van actieve complexen alle met een construct. Inderdaad alternatieve technologieën kunnen worden toegepast voor elk van deze verschillende aspecten, maar waarschijnlijk niet voor alle 23,24. Met de HaloTag technologie, kan een multifunctionele benadering worden gebruikt, oprukkende proteoics studies en het verkrijgen van een meer volledig begrip van eiwitfunctie in zoogdiercellen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken dr. Martin Rosenberg, Dr Gary Tarpley, en dr. Keith Wood voor de ondersteuning van dit werk, en Dr James Cali voor kritische lezing van het manuscript. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, en MU zijn medewerkers van Promega Corporation. MF, RJ, RA, en DA zijn medewerkers van MS BioWorks, LLC.
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS – tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-to 27- gauge needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em) | For optional imaging |